МОЛЕКУЛЯРНА БИОЛОГИЯ

[ROCK]

ИЗОЛИРАНЕ НА НК ОТ РАСТИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ ПО ФЕНОЛОВИЯ МЕТОД РАЗДЕЛЯНЕ НА ДНК И РНК ОТ РАСТИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

От химична гледна точка нуклеиновите киселини са дълги полимерни вериги, състоящи се от нуклеотиди, свързани помежду си с 3' - 5' фосфо-диестерни връзки в полинуклеотидна верига. Нуклеотидите са съставени от една азотна база, пентоза (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорен остатък, свързан с петият С атом на пентозата. Тази структура в основата си определя и методите за количествено определяне на нуклеиновите киселини.

Една група методи се основава на способността на азотните бази в нуклеотидите да поглъщат специфично ултравиолетова светлина. Поглъщането е пропорционално на количеството на нуклеиновите киселини.

Друга група методи има за основа химични реакции, касаещи пентозата и съдържащия се в нуклеиновите киселини фосфор, в резултат, на което се получава цветен продукт, който също може да бъде определен спектрофотометрично.

Методите за определяна на ДНК и РНК са общи поради малката разлика в техния химичен състав. Малко изключения правят два метода, които се основават на цветни реакции за рибоза и дезоксирибоза, които са донякъде специфични. По-голяма специфичност на определяне се постига при пред варителното разделяне на ДНК от РНК в процеса на тяхното изолиране от клетката. В това отношение е важна предварителната подготовка на мате риала. Затова се използва най-често методът на Шмит-Танхойзер, който се прилага както за животински, така и за растителни обекти. Методът може да се раздели на няколко основни етапа:

А. Премахване на киселинно-разтворимите съединения, като се използват ТХО и перхлорна киселина в различни концентрации на студено.

Б. Екстракция на липидите с органични разтворители. Предварително трябва да се отделят ТХО и перхлорната киселина, което се прави чрез промивка с 96% етанол, наситен с натриев ацетат. Може да се използва смес на етанол с диетилов етер (3:1) или чист етер.

В. Разделяне на ДНК и РНК. При мека алкална хидролиза РНК се разделя на нуклеотиди, докато ДНК е по-устойчива. Добавянето на кисе лина в края на хидролизата утаява ДНК, а РНК остава в разтвора.

Г. Екстракция на ДНК от утайката. Прави се чрез хидролиза в перхлорна киселина при нагряване.

Ход на работата. Претегля се 1 g растителен материал, стрива се щателно в порцеланов хаван и се екстрахира на студено с 5 mL 0,5 N перхлорна киселина (0-4°С). Хомогената се пренася в центрофужна епру ветка и се оставя на студено за 30 min. Центрофугира се на студено за 10 min. Надутаечната течност се изхвърля, а утайката се промива с 5 mL 0,2 N перхлорна киселина и отново се центрофугира. Утайката се промива последователно с 5 mL етанол на водна баня, до завиране на сместа и след това отново с етанол. След всяко промиване и центрофугиране надутаечната течност се изхвърля. Ако се използва зелена тъкан, екстракцията се провежда до пълно изчезване на зеления цвят на извлека. Към утайката се прибавя 2,5 mL вода и се хомогенизира. Към хомогената се добавя равен обем 0,6 М КОН. Предварителната хомогенизация препятства слепването на частиците след поставяне на основата. Полученият хомогенат се инкубира при 37°С за 1 h. Хомогенизираният материал се центрофугира при горните условия и надутаечната течност се събира. Утайката се промива двукратно с по 3 mL 0,3 М КОН и над утаечните течности се обединяват. Епруветката се поставя в ледена водна баня и след охлаждане в нея се налива на капки студена перхлорна киселина. Следи се рН на разтвора с лакмус и прибавянето на киселината се спира при получаване на слабо кисела реакция. Разтворът се разбърква енергично, след което концентрацията на перхлорната киселина се довежда до 0,5 М (изчислява се необходимото количество, като се държи сметка и за поставената киселина за неутрализиране). При това пада утайка от белтъци, ДНК и калиев перхлорат. Оставя се на студено за 15-20 min и се центрофугира. Утайката се промива на студено с 0,5 М перхлорна киселина, центрофугира се и двете супернатанти се обединяват, довеждат се до определен обем и се запазват. Утайката, съдържаща ДНК, белтъци и перхлорат се залива с 2,5 mL 0,5 М перхлорна киселина и сместа се държи на водна баня при 90°С за 30 min. При това става хидролиза на ДНК и разтваряне на калиевия перхлорат. Епруветката се охлажда, при което перхлората пада в утайка. Отново се центрофугира и надутаечната течност се отлива. Утайката се промива с 0,5 N перхлорна киселина, супернатантите се обединяват, довеждат се до определен обем и се запазват за анализ.

• Необходими уреди и материали: центрофуга; порцеланов хаван; центрофужни епруветки; водна баня; лед; 0,5 N и 0,2 N перхлорна киселина; етанол; 0,6 N КОН; 0,3 М КОН; лакмус; корени от грахови покълнеци.

[ROCK]

ИЗОЛИРАНЕ НА РИБОЗОМЛА РНК ОТ КОРЕНИ НА ГРАХ

За изолиране на РНК най-често се използва фенолния метод, както и при изолиране на ДНК. При това трябва да се имат предвид и някои особености. Фенолът като депротеинизиращ агент служи и за инхибиране на нуклеазите, но РНК-азите не се инхибират напълно, което е причина за ниския добив на РНК при изолиране. Освен това на стадия на депротеинизация в разтвора преминава и ДНК. Нейното отделяне с ДНК-аза е доста трудно, а и ензима има висока цена. От друга страна, продължителната депротеинизация допринася за разграждане на РНК. По тези причини съществуват и редица модификации на метода. Така например вместо фенол за депротеинизирането се използва хлороформ, прибавя се диетилпирокарбонат (ДЕПК) за инхибитор на РНК-азите, което доста повишава добива на РНК. При много методи се използва утаяване на РНК с ЗМ натриев ацетат, което изключва използване на ДНК-ази, тъй като при тези условия се утаява само РНК, а ДНК остава в разтвора. В разтвора остават и нискомолекулните РНК, което позволява изолирането само на рибозомна РНК. Тези процедури изискват само една депротеинизация на разтвора с РНК.

Ход на работата. 10 g корени от грах се стриват в порцеланов хаван с кварцов пясък на порции, докато се получи фин хомогенат. Добавят се 10 обема от изолиращата среда и получената суспензия се оставя 30 min за екстракция. Посочените операции се провеждат при температура 4°С. След престоя стритият материал се инкубира при 37°С за 5 min при разбъркване. Добавя се равен по обем наситен с вода фенол, сместа се разбърква при 37°С за още 1-2 min и бързо се охлажда в ледена баня. Центрофугира се при 4000 грт за 20 min на центрофуга К23. Събира се надутаечната течност и към нея се добавя кристален натриев ацетат до достигане на концентрация ЗМ. Сместа се охлажда до - 15°С и се държи при същата температура една нощ за пълно отделяне на утайката (по-голямата част РНК се отделя след престой около 30 min). Утайката се отделя чрез центрофугиране при 15 000 rpm на центрофуга за 15 min.

В резултат на тези операции в утайката се получава основно рибозомна РНК, а транспортните (тРНК) и ДНК остават в надутаечната течност. Утайката може да се разтвори отново в трис-фосфаген буфер и да се утаи, при което става нейното пречистване. Накрая РНК се промива двукратно със студен етанол, разтваря се в същият буфер и се съхранява при -20°С.

Необходими уреди и материали, центрофуга, термостат (водна баня за 37°С); ледена баня; хладилна камера; изолираща среда - 0,5 MNaCl, 100 тМ буфер трис-HCl, рН 7, 10 mMMg С1Ъ 20% етанол (обемно), 3% SDS, 20 ptL/rnL диетилпирокарбонат; 36 тМ трис-фосфатен буфер с рН 7,6, съдържащ 1 тМ ЕДТА, 10% захароза, 0,1% SDS; 10 mM MgCl2; дестилиран фенол с рН 7,6; натриев ацетат; етанол.

[ROCK]

ИЗОЛИРАНЕ НА РНК ОТ ПРЕСОВАНИ ДРОЖДИ

За получаването на РНК се използуват пресовани дрожди Нуклеопротеините от дрожди се подлагат на алкална хидролиза на студено. Отделеният от тях белтък също частично се хидролизира до аминокиселини.

След разкъсване на 5' - З'«фосфодиестерните връзки се получава!

мононуклеотиди, които се хидролизират последователно до

фосфат, а нуклеозидите - до бази и пенгози (рибоза и дезоксирибоза)

Начин на работа: 10 g хлебна мая се поставя в облодънна колба.Добавят се 200 ml 5% разтвор на сярна киселина и добре се суспендира с внимателно разклащане. Суспензията се вари на обратен хладник в продължение на 60 min. Хидролизатът се охлажда, филтрува ) след което се доказват продуктите от хидролизата.

ИЗОЛИРАНЕ НА РНК ОТ ПРЕСОВАНИ ДРОЖДИ

За получаването на РНК се използуват пресовани дрожди Нуклеопротеините от дрожди се подлагат на алкална хидролиза на студено. Отделеният от тях белтък също частично се хидролизира до аминокиселини. След разкъсване на 5' - 3'-фосфодиестерните връзки се получават мононуклеотиди, които се хидролизират последователно до нуклеозиди и фосфат, а нуклеозидите - до бази и пентози (рибоза и дезоксирибоза).

Начин на р а б о т а : 15 g хлебна мая се суспендира в 70 mL охладена при 0°С вода. При постоянно размесване се добавя предварително охладен разтвор на NaOH и сместа се оставя да престои 60 min. След това се подкиселява (лакмус) с оцетна киселина - около 5 mL - и сместа се филтрува. Към прозрачния филтрат се прибавя двоен обем охладен етанол и РНК се утаяват на студено. Препаратът на РНК се пречиства неколкократно чрез разтваряне във вода и ново утаяване с етанол. Утайката може да се изсуши на въздух след промиване с ацетон.

Използвани реактиви : 30 g натриева основа в 90 mL вода; ледена оцетна киселина; 96% етанол.

[ROCK]

ОПРЕДЕЛЯНЕ КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА РНК С ОРЦИН

Орцинът се използва за определяне количеството на РНК поради спе цифичната разлика между рибоза! а и дезоксирибозата. Реакцията, е специ фична за алдопентозите, които с подкислен разтвор на орцин дават зелено оцветяване. По тази начин могат да се определят и рибонуклеотиди в разтвор или в клетъчен екстракт.

Ход на работата. 80 mg растителен материал (коренчета от грахови покълнеци) се стрива с 2 mL 0,25 N перхлорна киселина. Подкислената проба се охлажда на ледена водна баня за 30 min и се центрофугира при 10 000 rpm на хладилна центрофуга при 0°С за 10 min. Остатъкът, съдържащ нуклеиновите киселини се ресуспендира в 0,5 mL 0,5 N перхлорна киселина, добавя се 3,5 mL от същия разтвор и съдържимото на епруветката се разбърква. Получената суспензия се охлажда и се центрофугира при 5 000 rpm за 10 min. Остатъкът се екстрахира отново при същите условия и двата екстракта се обединяват, размесват се добре и се измерва общият обем, необходим за изчисление количествата на РНК.

За определяне на РНК 1 mL от полученият екстракт се смесва с два обема орцинов реагент и сместа се нагрява при 90°С за 30 min. Епруветката се охлажда в струя студена вода и полученото зелено оцветяване се фотометрира при 665 nm на Спекол 20. Едновременно с това се прави и празна проба, при която вместо екстракт се прибавя 1 mL вода и получената смес се използва за нулева проба при измерване на екстинкцията Количеството на РНК се определя от предварително построена калибровъчна крива.

Необходими уреди и материали. Спекол 20; центрофуга; порцеланов хаван; ледена водна баня; 0,25 и 0,5 N перхлорна киселина; изходен разтвор на РНК (100 ug/mL); орцинов реагент -6% разтвор на орцинол в етанол и 0,1% разтвор на FeCh. 6Н20 в концентрирана НС1 се смесват, в деня на определянето в равни съотношения (готовият разтвор има светложълт цвят и е нетраен).

Забележка: Когато като изходен разтвор се използва РНК разтво¬рът се приготвя с 0,25 М перхлорна киселина и предварително се нагрява за хидролизират. След това се добавя равен обем 0,1 N НС1 до окончателна концентрация на РНК 100 fig ml.,.

[ROCK]

ОПРЕДЕЛЯНЕ КОНЦЕНТРАЦИЯТА НА ДНК ПО МЕТОДА НА ДИШЕ

За определяне на количеството на нуклеиновите киселини по техните азотни бази често се използва реакцията с дифениламин, с който метод най-често се определя ДНК.

Ход на работата. Като изходен материал за определяне на ДНК се използва растителна тъкан. 50-60 mg растителен материал (корени от грахови или царевични покълнеци) се нарязва на ситно и се стрива в порцеланов хаван с помощта на 1 mL 1 N NaOH. С още 1 mL от разтвора получената суспензия се прехвърля количествено в центрофужна епруветка и се нагрява 5 min на вряща водна баня. Получената прозрачна, леко опалесцираща течност се охлажда постепенно до стайна температура, след което се поставя в ледена водна баня. Прибавя се 1 mL наситен разтвор на NaCl, приготвен в 20 mL оцетна киселина. След 2-3 min пада утайка от белтъци, която се отделя чрез центрофугиране при 3500 rpm на центрофуга К23 при охлаждане. Надутаечната течност, която съдържа хидролизираната ДНК се запазва и в нея се налива 6 mL етанол, при което ДНК пада в утайка. За пълно формиране на утайката разтворът се оставя още 30 min в 0 ТТ£ хладилник. Центрофугира се 10 min при 3000 rpm и^ъм утайката се прибавя 5 mL 0,5 N разтвор на перхлорна киселина за разтваряне на ДНК. Това става при нагряване на разтвора 15 min на вряща водна баня с обратен хладник. В получения разтвор се определя количеството на ДНК по метода на Дише както следва:

Към 1 mL от охладения разтвор на ДНК се добавя внимателно, на капки, двоен обем разтвор на Дише, съдържащ дифениламин. Сместа се разбърква добре и се поставя на вряща водна баня за 15 min, през което време се формира синьо оцветяване, което се спектрофотометрира при 600 nm. Количеството на ДНК се намира по калибровъчна крива.

• Необходими уреди и материали. Центрофуга К2'4; Спекол 20; пор¬целанов хаван; епруветка с обратен хладник; 1 N NaOH; наситен разтвор на NaCl; 0,5 N перхлорна киселина; реактив на Дише - lg дифениламин (прекристализиран от етанол) се разтваря в смес от 2,75 mL кН2$()^ и J00 mL ледена оцетна киселина; изходен разтвор на ДНК- 10 mg в 5 mL 0,0IN NaOH; спектрофотометър.

[ROCK]

ИЗОЛИРАНЕ НА НК ОТ РАСТИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ ПО

ФЕНОЛОВИЯ МЕТОД РАЗДЕЛЯНЕ НА ДНК И РНК

ОТ РАСТИТЕЛЕН МАТЕРИАЛ

От химична гледна точка нуклеиновите киселини са дълги полимерни вериги, състоящи се от нуклеотиди, свързани помежду си с 3' - 5' фосфо-диестерни връзки в полинуклеотидна верига. Нуклеотидите са съставени от една азотна база, пентоза (рибоза или дезоксирибоза) и фосфорен остатък, свързан с петият С атом на пентозата. Тази структура в основата си определя и методите за количествено определяне на нуклеиновите киселини.

Една група методи се основава на способността на азотните бази в нуклеотидите да поглъщат специфично ултравиолетова светлина Поглъщането е пропорционално на количеството на нуклеиновите киселини.

Друга група методи има за основа химични реакции, касаещи пентозата и съдържащия се в нуклеиновите киселини фосфор, в резултат, на което се получава цветен продукт, който също може да бъде определен спектрофотометрично.

Методите за определяна на ДНК и РНК са обши поради малката разлика в техния химичен състав. Малко изключения правят два метода, които се основават на цветни реакции за рибоза и дезоксирибоза, които са донякъде специфични. По-голяма специфичност на определяне се постига при пред варителното разделяне на ДНК от РНК в процеса на тяхното изолиране от клетката В това отношение е важна предварителната подготовка на мате риала. Затова се използва най-често методът на Шмит-Танхойзер, който се прилага както за животински, така и за растителни обекти. Методът може да се раздели на няколко основни етапа:

А. Премахване на киселинно-разтворимите съединения, като се използват ТХО и перхлорна киселина в различни концентрации на студено.

Б. Екстракция на липидите с органични разтворители. Предварително трябва да се отделят ТХО и перхторната киселина, което се прави чрез промивка с 96% етанол, наситен с натриев ацетат. Може да се използва смес на етанол с диетилов етер (3:1) или чист етер.

В. Разделяне на ДНК и РНК. При мека алкална хидролиза РНК се разделя на нуклеотиди, докато ДНК е по-устойчива. Добавянето на кисе лина в края на хидролизата утаява ДНК, а РНК остава в разтвора.

Г. Екстракция на ДНК от утайката. Прави се чрез хидролиза в перхлорна киселина при нагряване.

Хол t\p работата. Претегля се 1 g растителен материал, стрива се щателно в порцеланов хаван и се екстрахира на студено с 5 mL 0,5 N перхлорна киселина (0-4°С). Хомогената се пренася в центрофужна епру ветка и се оставя на студено за 30 min. Центрофугира се на студено за 10 min. Надутаечната течност се изхвърля, а утайката се промива с 5 mL 0,2 N перхлорна киселина и отново се центрофугира. Утайката се промива последователно с 5 mL етанол на водна баня, до завиране на сместа и след това отново с етанол След всяко промиване и центрофугиране надутаечната течност се изхвърля. Ако се използва зелена тъкан, екстракцията се провежда до пълно изчезване на зеления цвят на извлека. Към утайката се прибавя 2,5 mL вода и се хомогенизира. Към хомогената се добавя равен обем 0,6 М КОН. Предварителната хомогенизация препятства слепването на частиците след поставяне на основата. Полученият хомогенат се инкубира при 37°С за 1 Ь Хомогенизираният материал се центрофугира при горните условия и надутаечната течност се събира. Утайката се промива двукратно с по 3 mL 0,3 М КОН и надутаечните течности се обединяват. Епруветката се поставя в цедена водна баня и след охлаждане в нея се налива на капки студена пепх:юрна киселина. Следи се рН на разтвора с лакмус и прибавянето на киселината се спира при получаване на слабо кисела реакция(4 мл 0,5 Н перхлорна киселина). Разтворът се разбърква енергично, след което концентрацията на перхлорната киселина се довежда до 0,5 М (изчислява се необходимото количество, като се държи сметка и за поставената киселина за неутрализиране). При това пада утайка от белтъци, ДНК и калиев перхлорат. Оставя се на студено|за 15-20 min и се центрофугира. Утайката се промива на студено с 0,5 М перхлорна киселина, центрофугира се и двете супернатанти се обединяват, довеждат се до определен обем и се запазват. Утайката, съдържаща ДНК, белтъци и перхлорат се залива с 2,5 mL 0,5 М перхлорна киселина и сместа се държи на водна баня при 90°С за 30 min. При това става хидролиза на ДНК и разтваряне на калиевия перхлорат. Епруветката се охлажда, при което лерхлората, пада в утайка. Отново се центрофугира и надутаечната течност се отлива. Утайката се промива с 0,5 N перхлорна киселина, супернатантите се обединяват, довеждат се до определен обем и се запазват за анализ.

• Необходими уреди и материали: центрофуга; порцеланов хаван; центрофужни епруветки; водна баня; лед; 0,5 N и 0,2 N перхлорна киселина; етанол; 0,6 N КОН; 0,3 М КОН; лакмус; корени от грахови покълнеш.

[ROCK]

ИЗОЛИРАНЕ НА РИБОЗОМНА РНК ОТ КОРЕНИ НА ГРАХ

За изолиране на РНК най-често се използва фенолния метод, както и при изолиране на ДНК. При това трябва да се имат предвид и някои особености. Фенолът като депротеинизиращ агент служи и за инхибиране на нуклеазите, но РНК-азите не се инхибират напълно, което е причина за ниския добив на РНК при изолиране. Освен това на стадия на депротеинизация в разтвора преминава и ДНК. Нейното отделяне с ДНК-аза е доста трудно, а и ензима има висока цена. От друга страна, продължителната депротеинизация допринася за разграждане на РНК. По тези причини съществуват и редица модификации на метода. Така например вместо фенол за депротеинизирането се използва хлороформ, прибавя се диетилпирокарбонат (ДЕПК) за инхибитор на РНК-азите, което доста повишава добива на РНК. При много методи се използва утаяване на РНК с ЗМ натриев ацетат, което изключва използване на ДНК-ази, тъй като при тези условия се утаява само РНК, а ДНК остава в разтвора. В разтвора остават и нискомолекулните РНК, което позволява изолирането само на рибозомна РНК. Тези процедури изискват само една депротеинизация на разтвора с РНК.

Ход на работата. 10 g корени от грах се стриват в порцеланов хаван с кварцов пясък на порции, докато се получи фин хомогенат. Добавял се 10 обема от изолиращата среда и получената суспензия се оставя 30 min за екстракция. Посочените операции се провеждал при температура 4°С. След престоя стритият материал се инкубира при 37°С за 5 min при разбъркване. Добавя се равен по обем наситен с вода фенол, сместа се разбърква при 37°С за още 1-2 min и бързо се охлажда в ледена баня Центрофугира се при 4000 rpm за 20 min на центрофуга К23. Събира се надутаечната течност и към нея се добавя кристален натриев ацетат до достигане на концентрация ЗМ. Сместа се охлажда до - 15°С и се държи при същата

(→ 1г, натриев ацетат)

температура една нощ за пълно отделяне на утайката (по-голямата част РНК се отделя след престой около 30 min). Утайката се отделя чрез центрофугиране при 15 000 rpm за 15 мин. Утайката + 2 мл буфер, разбърква се и се запазва в хладилник за последващоопределяне с орцин.

В резултат на тези операции в утайката се получава основно рибозимна РНК, а транспортните (тРНК) и ДНК остават в надутаечната течност. Утайката може да се разтвори отново в трис-фосфатен буфер и да се утаи, при което става нейното пречистване. Накрая РНК се промива двукратно със

студен етанол, разтваря се в същият буфер и се съхранява при -20°С.

Необходими уреди и материали, центрофуга, термостат (водна баня за 3 7°С.); ледена баня; хладилна камера: изолираща среда - 0,5 М Nad, 100 тМ буфер трис-НО, рН 7, 10 тМMg Cl2, 20% етанол (обемно), 3% SDS, 20 uLmL диетилпирокарбонат; 36 тМ трис-фосфатен буфер с рН 7,6, съдържащ 1 тМ ЕДТА, 10% захароза, 0,1% SDS; 10 mM MgCl2; дестилиран фенол срН 7,6; натриев ацетат; етанол.

[ROCK]

ДОКАЗВАНЕ НА РНК ИЗОЛИРАНА ОТ ПРЕСОВАНИ ДРОЖДИ

а./ Доказване на белтък. Към 1 mL разтвор се добавят 2 mL 10%

разтвор на натриева основа и 2-3 капки 1% разтвор на меден сулфат.

Получава се розововиолетово оцветяване.

б./ Доказване на алдозахари с фелингова проба. Към 2 mL

филтрат се прибавя на капки 10% разтвор на натриева основа до

неутрална реакция (лакмус). В друга епруветка се поставят фелинг I и

фелинг II. Съдържимото на двете епруветки се нагрява до кипене и се

смесва. Продължава да се нагрява и при положителна проба пада

керемиденочервена утайка от купроокис.

в./ Доказване на пуринови бази. Към 1-2 mL хидролизат се добавят

5-6 капки амоняк до алкална реакция (проверява се с лакмус), след

което се добавя на капки 5% разтвор от сребърен нитрат до получаване

на белезникава утайка до сребърно съединение, на пуриновите бази. С

течение на времето утайката става кафява.

г./ Доказване на ортофосфат. Към 0,5 mL хидролизат се добавят 5

mL дестилирана вода, 0,5 mL 10% разтвор от сярна киселина, 0,5 mL 5%

разтвор от амониев молибдад и 0,5 mL 0,2% разтвор на скорбинова

киселина Размесва се добре съдържанието на епруветката. След 10 min се

появява синьо оцветяване (фосфомолибденово синьо).

Използвани реактиви: реактиви за биуретова реакция, реактиви за фелингова проба, амоняк, 5% разтвор от сребърен нитрат; реактиви за доказване на фосфат по фосфомолибденово синьо