DesertFox

Ето ви една тема за производството на еритритол. Насочена е основно към МБ му получаване, но не срещнах подраздел Биотехнологии. За да се вижда от търсачките ще я пусна освен като прикачен фаил и като текст. Ако модераторът не го хареса, нека го изтрие и остави само прикачения. Edit- картинките, таблиците и оформлението не са излезли като хората, но можете да си ги видите в прикачения фаил, I. Въведение Хранително вкусовата и биотехнологичната промишленост се опитват да удовлетворят търсенето на вкусна и здравословна храна. Модерният начин на живот, както и напредъкът в медицината, водят до промени в начина на хранене на хората. За съжаление, благодарение на тези промени, много хора стават жертви на т.нар. „заболявания на цивилизования свят”, като кариеси, диабет, рак и ревматизъм. През последните години се появяват доказателства, че сред основните причини за тези заболявания са промените в хранителните навици. Осъзнава се ролята, която храните имат в крехкото равновесие между здравословното и вкусното. През последните 20 години науките за храненето и медицината изследват механизмите, чрез които хранителните навици въздействат върху превантивното лечение на „заболяванията на цивилизования свят”, но въпреки прогреса в тази насока, има големи пропуски. Първоначално е доказана връзката между поемането на големи количества калории и свръхтеглото. Затова лекарите започват да препоръчват намаляване на количеството приемани калории, най-вече такива, чиито източник са мазнините, за сметка на повече сложни въглехидрати, както и заместването на моно- и дизахаридите в храната с полизахариди. Потребителите се ориентират към консумация на по-ниско калорични храни и храни без захар, не само заради медицинските последствия, но и заради модерните представи за красота. Истинността на тези твърдения се потвърждава и от повишаването на производството и търсенето на т.нар. „леки” храни. За 20 % от всички нови хранителни продукти, пуснати на пазара през последната година, се твърди, че имат поне един полезен за здравето ефект- от намаляване на приетите калории до превантивно влияние върху различни заболявания. Пазарът на храни, несъдържащи захар, се развива като отделна пазарна ниша[2, 12]. Заместването на захарта води не само до намаляване на калориите, но и продуктите-заместители са „tooth friendly”, което означава, че за разлика от захарта, те не предизвикват дентални заболявания. Прекомерната консумация на продукти съдържащи захар, от деца- основни техни консуматори, води до сериозни здравословни проблеми. Несъдържащите захар продукти предлагат нужната алтернатива. Въпреки наличието на голям брой различни заместители, някой от които имат дори анти-кариесен ефект (ксилитол), добавянето им в различни хранителни продукти не винаги позволява да се достигне необходимото качество на храните. Главните недостатъци на тези продукти са: недостатъчно намаляване на калориите (ЕС изисква минимум 30%); странични ефекти, които ограничават използването им; ограничена разтворимост; нееднакви вкусови качества (най-вече при смесването им с други подсладители); трудни са за съхранение. [2] За да се избегнат описаните недостатъци се изследват и прилагат по-рядко използвани до момента вещества. Едно от тях е ертитритолът- той предлага нови функционални и вкусови качества. Принадлежи към реда на полиолите- висши алкохоли, производни на монозахаридите. Целта на настоящата дипломна работа е да се направи литературен обзор върху свойствата, методите за получаване и приложението на еритритол. II.Литературен обзор 1.Химични и биологични свойства на полиолите Полиоли е съкратеното название на полихидроксиалкохолите. Те се получават при хидрогениране на захари. Някои от тях се срещат и в природата, в различни плодове като ягоди, малини, ябълки и круши. Употребяват се в хранително-вкусовата промишленост (ХВП) като съставки на бонбони, дъвки, шоколади, сладоледи и др. Предимството на захарните алкохоли пред нормалните захари е намаленото енергиино съдържание на първите (2,1 kcal/g в сравнение с 4,0 kcal/g). Използват се в производството на нискокалорични храни, подходящи и за диабетици. Полиолите се абсорбират в храносмилателния тракт по-бавно от захарите. При консумацията им пиковата концентрация на кръвна захар е по-ниска, спрямо консумацията на захари, което води до по-слаб инсулинов отговор (по-нисък гликемичен индекс). Полиолите са некариогенни, т.е. не спомагат образуването на кариеси. Притежават също така охлаждащ ефект, подобен на този при ментата, който ги прави подходящи за производството на освежители за уста. Някои физико-химични данни за полиолите са представени в таблица 1, Таблица 1 Физикохимични данни за полиолите Наименова-ние Брой на C атоми Молекулна маса Тт [°C] pH граници на стабилност Разтворимост във вода [%], (при 25°C) Еритритол 4 122 126 2 до 12 37 Ксилитол 5 152 94 2 до 10 64 Манитол 6 182 165 2 до 10 20 Сорбитол 6 182 97 2 до 10 70 Малитол 12 344 150 2 до 10 60 Лактитол 12 344 122 2 до 10 под 3 докато в таблица 2 са посочени основните органолептични свойства на полиолите [18,20]. Таблица 2 Органолептични свойства на полиолите Полиол Изходен монозаха- рид Относителна сладост (в сравнение със захарозата) [%] Охлаждащ ефект Енергийна стойност [kcal/g] Сорбитол Глюкоза, Фруктоза 55-60 4,4 3 Лактитол Лактоза 90 1,4 2 Манитол Маноза 50-60 - 1,6 Ксилитол Ксилоза над 90 6,7 3 Малитол Малтоза над 90 - 3 Еритритол Еритроза 60-80[21] над 7 0* * В Европейския съюз еритритолът е единственият подсладител, приет за подсладител с нулева калоричност. Това става с директива номер 2008/100/EC. Всички страни членки трябва да отразят това в своето законодателство до 31 октомври 2009 година [23]. U.S. Food and Drug Administration разрешава обозначаването на продукти, съдържащи полиоли като „sugar free” (не съдържащи захар), както и като „Does not promote tooth decay” (не предразполагащи към дентални заболявания), но само ако продуктът не съдържа други захароподобни продукти. Причината полиолите да не увреждат зъбите неспособността на бактериите, причиняващи дентални заболявания, да ги включват в метаболизма си. При използването на захарните алкохоли в хранително-вкусовата промишленост, трябва да се взема предвид и свойството им да действат като слабителни средства. Прагът им на действие е строго индивидуален [18]. В някои специфични клетки разграждането на полиолите може да замени частично доминантните глюкозни пътища. Като пример могат да се посочат половите клетки на бозайниците, където протича следната реакция: R е различен заместител, в зависимост от вида на междинния полиол. Полиолите като еритритол, сорбитол и други служат и като криопротектори в много растения, насекоми и други организми. [10] 2. Химични, физикохимични и биологични свойства на еритритола Еритролът представлява линейна въглехидратна молекула, състояща се от 4 въглеродни атома, всеки от които е свързан с по една хидрооксилна група. Принадлежи към класа на полиолите. Молекулата на еритритола съдържа два оптически активни въглеродни атома, като на всеки от тях съответстват по два оптични изомера, т.е. предполага се наличието на четири оптични изомера. На практика при еритритола са установени три различни изомера. Ако и двата оптично активни атома са с еднакви конфигурации, т.е. едновременно или и двете са L, или и двете са D, то в първия случай ще се наблюдава въртене на светлината на ляво, а във втория - надясно. В третия възможен изомер се наблюдават един D- и един L- въглероден атом (поради симетричността на молекулата този изомер е идентичен с теоретично възможния четвърти). Те завъртат светлината в две взаимнопротивоположни посоки, което на практика води до вътрешна компенсация и до оптически неактивна молекула. Тази форма се нарича мезоформа. [1] Чистият еритритол кристализира под формата на безводни кристали, със сладък вкус, без наличието на остатъчни вкусове и миризми. Кристалите са прозрачно бели, блестящи и при разтваряне във вода дават безцветен, не вискозен разтвор. Химичните свойства на еритритола са подобни на тези на останалите полиоли. Поради липсата на редуцираща крайна група се характеризира с висока температурна и киселинна стабилност. Притежава сравнително ниска разтворимост, също като манитола. Еритритолът има по-ниска молекулна маса от другите полиоли, използвани като захарни заместители, което обуславя различните му физични свойства- напр. високо осмотично налягане. Tемпературата му на топене е 120°C, а на кипене 330°C. Еритритолът се среща в голям брой микроорганизми, растения и животни. Той е краен продукт в метаболизма на гъби, дрожди и бактерии. Среща се в малки количества и във висшите организми, като например- в полените на цветята, както и в плодове- пъпеши, круши и грозде, както и в кръвта на крави и други бозайници. В човешкото тяло следи от него се намират в очните лещи, в семенната течност и в кръвния ток. Както и другите захарни алкохоли се среща в минимална концентрация и в урината. Той е най-често срещания полиол в урината и може да достигне концентрации от 10-30 mg/l. Нормалните концентрации, обаче са по-ниски, както е посочено в таблица 3. [4] Произхода на еритритола в бозайниците още не е напълно изяснен- не е известно, дали се получава в следствие на нормалната въглеводородна обмяна на висшия организъм или е продукт от метаболизма на синергично живеещите микроорганизми- като чревната микрофлора например. Таблица 3 Екскреция на полиоли в човешката урина Полиоли в човешката урина Екскреция [μmol/day] Сорбитол 53 Манитол 153 Рибитол 53 Ксилитол 53 Арабитол 293 Еритритол 912 Треитол 10 Тъй като еритритолът участва в метаболизма на част от микроорганизмите, е нормално той да се среща в различни продукти, особено такива получени чрез ферментационни технологии- като вино, саке, соев сос и др. От скоро съдържанието на захарни алкохоли в спиртните напитки и виното се използва като доказателство за автентичност на продуктите. Съдържанието на еритритол в различните храни и напитки е посочено в таблица 4. [4] Таблица 4 Съдържание на еритритол в някои храни и ферментационно получени продукти Храна Съдържание на еритритол Вино 130-300 mg/l Шери 70 mg/l Саке 1550 mg/l Соев сос 910 mg/l Пъпеши 22 до 47 mg/kg Круши 0 до 40 mg/kg Грозде 0 до 42 mg/kg Детайлно изследване върху метаболизма на еритритола при бозайниците е проведено върху плъхове с помощта на радиоактивния изотоп на въглерода- 14C. След перорален прием на еритритол, е проследена концентрацита му в дъха, урината и екскрементите. Мъжки плъхове приемат белязан еритритол по 0,1 g/kg, от които 6% се отделят чрез дъха, а 88% - чрез урината (за 24h). Интравенозни изследвания сочат, че само 1% от получения 14CO2 би трябвало да се отделя чрез дъха. Разликата се дължи на факта, че по- голямата част от действително отделяния 14CO2 е продукт на ферментация, протичаща в чревната микрофлора. Тъй като микроорганизмите се адаптират към субстрата експериментът е продължен, като плъховете са подложени на диета съдържаща 10% еритритол за 2 седмици. Ефектът е повишаване на 14CO2 до 10%. Подобни експерименти са проведени отново с плъхове и доказват, че чревната микрофлора е отговорна за трансформацията на еритритол до CO2. Изследвани са плъхове, приемали ултра-пречистен 14C-еритритол. Устновено е, че 98% от радиоактивния 14C се отделят с урината за 24 часа, което показва, че еритритолът се абсорбира много бързо в тънките черва, след което се отделя с урината, а до колониите в дебелото достигат само 2%. Подобни резултати са получени и при хора. Изследванията са извърщени чрез проследяване на естествено срещащия се изотоп 13C. Липсата на еритритолов метаболизъм в човешкото тяло се доказва, чрез уринен анализ- над 50% от еритритола се отделя с урината до 6 часа, а до 24 часа достига 84%. На фигура 1 е представена екскрецията на еритритол чрез човешката урина за 24 часа. [5] Фигура 1. Екскреция на еритритол от човешкия организъм 3.Методи за получаване Биосинтез Някои микроорганизми синтезират еритритол, което, както ще стане ясно по-долу, се използва от биотехнологиите за промишленото му получаване. Схемата на трансформация на глюкозата до еритритол в клетките на микроорганизмите е показана на фигура 2. [15] Фигура 2. Биосинтез на манитол и еритритол Химични методи Съществуват и химични методи за получаване на еритритол на основата на редукцията на еритроза. Тяхната производителност обаче не е задоволителна и затова се използват биотехнологичните методи. [7] Биотехнологични методи Еритритолът може да бъде получен по биотехнологичен път, чрез използването на осмофилни дрожди и някои видове бактерии. За промишленото му добиване се използват генномодифицирани форми на Aureobasidium, изолирани от Nikken Chemical в сътрудничество с National Research Institute of Japan. Съществуват и множество други, различни начини за микробиологично получаване на еритритол. Обект на настоящата дипломна работа е получаването на еритритол от дрожди от вида Torula sp. Сравнителни данни за процесите, които могат да бъдат използвани за промишлено получаване на еритритол с различни видове дрожди, са показани в таблица 5. [6,11] Таблица 5 Данни за производителността на различни видове микроорганизми, използвани за промишлено получаване на еритритол Използван микроорганизъм Глюкоза [g/l] Еритритол [g/l] Qp [g/(l*h)] Yp/s [g/g] Auerobasidium sp.* 400 175 1,82 0,44 Moniliella tomentosa var. pollinis** 357 133 0,79 0,37 Trichosporon sp.*** 300 138 1,23 0,46 Trichosporon sp. при полунепрекъснат процес*** 333 150 1,50 0,45 Torula sp. 300 160 2,19 0,48 Torula sp. при полунепрекъснат процес 400 192 2,26 0,48 * Izhiuka H, G Wako, T Kasumi and T Sasaki, J Ferment Bioeng, 1989 ** Hanjiny GJ, Smith JH and JC Garver, Appl Microbiol 12, 1964 *** Park JB, BC Ceo, JR Kim and YK Park, J Ferment Bioeng, 1998 Най-високата производителност, достигната до момента, в получаването на еритритол е получена от Aureobasidium sp., култивирана в среда с концентрация на глюкоза от 400 g/l. Достигната е концентрация на еритритол от 175 g/l и за достигането й са били необходими над 96 часа. Това води до специфична обемна производителност от 1,82 g/(l*h). Тази стойност е значително по-малка от показаната при използване на Torula sp. Интересно е сравнението между Torula sp. и Trichosporon sp.- и двете култивирани при полунепрекъснат процес- Torula sp. показва 150% по-висока производителност, както и 10% по-висок добивен коефициент на продукта. Посочените данни сочат използването на Torula sp. като най-ефективният метод за микробиологично получаване на еритритол. Затова и в настоящата работа се обсъжда използването на Torula sp. Torula sp. са дрожди, клетките на които са сферични и с устойчиви стени. Според някои източници принадлежат към род Candida, докато според други те са отделен род. Терминът Torul sp. в текста се използва за щам на Torula, изолиран в R&D Center of Bolak (Осан, Южна Корея). В протоплазмата си съдържат голям брой мастни включения. При високо съдържание на мазнини в субстрата формата им варира от овална до удължена. Образуват тъмно кафяви на цвят колонии с перест контур. Хифите им са септирани, кафяви на цвят. Предизвикват някои алергии и асма. Клетките са подредени в оранжеви нишки, от 4 до 6 клетки[22,24]. Наблюдавани под микроскоп клетки и колонии са показани съответно на фигури 3 и 4. Фигура 3 Фигура 4 Хранителна среда Биотехнологията се основава на получаването на търсения продукт за сметка на метаболизма на клетките. Влияние върху метаболизма, освен вида на микроорганизма, оказват и условията на средата- pH, температура, хранителна среда и др. В посочените по-долу експерименти pH-то е поддържано 5,5, а температурата- 34° С- оптимални условия за развитието на Torula sp. Основната част от хранителната среда е въглеродния източник. За целите на настоящата дипломна работа сме разгледали използването на най-простия въглероден източник- глюкозата. Коментират се изследвания върху Torula sp. проведени в Sejong University и в BioNgene- Южна Корея. Първото изследване е върху влиянието на концентрацията на глюкоза върху производителността по отношение на еритритола и е проведено в колектив D-K Oh, C-H Cho, J-K Lee and S-Y Kim. Използваните дрожди са изолирани от 40% разтвор на захароза и са поставени в хранителна среда (за първично култивиране) съдържаща 10 g l-1 дрождев екстракт, 200 g l-1 глюкоза, 10 g l-1 MnSO4 . 4H2O и 2 g l-1 CuSO4 . 5H2О. За изясняване влиянието на фосфатната концентрация върху развитието на дрождите са добавени допълнителни количества фосфати- фитинова киселина. В полупромишлените ферментори използвани за същинските експерименти въглеродният източник е глюкоза в концентрация 400 g l-1, а азотния- дрождев хидролизат с концентрация 20 g l-1. Експерименталната ферментация е проведена по следната схема: Самостоятелна колония от Torula sp. се инокулира в тестова епруветка, с диаметър 20mm, съдържаща 5 ml хранителна среда при енергично разбъркване (250 rpm) за 48 часа. 5ml от съдържимото на епруветката се пренася в лабораторен ферментор от 500 ml, съдържащ 100 ml хранителна среда. Култивацията се извършва отново при температура 30 °С и при разбъркване със скорост 250rpm, за 24 часа. Получената култура, използвана за тестове при периодичен процес, се пренеся във ферментор от 5 l, съдържащ 3 l хранителна среда при температура 34 °С и pH 5,5. Работният обем при полунепрекъснатия (fed-batch) процес е 3,0 l, като допълнителното подхранване с глюкоза е осъществено с помощта на помпа, чрез която непрекъснато се въвежда 80 % разтвор на глюкоза в реактора. Температурата и pH са поддържани на оптималното за процеса ниво- съответно 34° C и pH 5,5. И при двата процеса скоростта на разбъркване е поддържана от 500 до 850 rpm, за да се осигури концентрация на разтворен кислород над 20%. Теглото на сухите клетки се отчита чрез измерване на светлинната абсорция и сравняването й с предварително построена калибрационна крива. Количеството на разтворения кислород се определя чрез използване на полярографичен електрод. Фосфатната концентрация- по метода на Мърфи и Райли (фотометрично измерване на комплекс между фосфатните остатъци и молибден). Концентрацията на глюкоза и еритритол се измерва чрез ВЕТХ- с подвижна фаза- ацетонитрил/вода и рефракционен детектор. Повишаването на началната концентрация на глюкоза при периодичните процеси води до повишаване на продуктивността. Това важи с особена сила за осмофилни микроорганизми, каквито са Torula sp. За да се определи с точност необходимото количество на глюкоза в началото на процеса, данните от периодичния процес, описан по-горе са изведени в таблица 6. Таблица 6 Експериментални данни за въздействието на глюкозната концентрация върху производството на еритритол от Torula sp. Глюкоза [g/l] Клетъчна маса [g/l] Еритритол [g/l] μmax [1/h] Qp [g/(l*h)] Yp/s [g/g] Време [h] 200 18,9 82 0,036 1,03 0,41 80 250 21,1 113 0,036 1,41 0,45 80 300 22,4 160 0,034 2,19 0,53 73 350 20,4 180 0,033 1,80 0,51 100 400 18 193 0,032 1,43 0,41 135 Както се вижда, повишаването на началната концентрация на глюкоза води до повишаване на крайната концентрация на еритритол, но намалява специфичната скорост на размножаване. Добивният коефициент на еритритола (Yp/s), специфичната обемна производителност (Qp), както и клетъчната маса в края на процеса са максимални при концентрация на глюкозата от 300 g/l. При тази концентрация се наблюдава и най-кратко генерационно време. Обемната производителност при концентрации под 300 g/l намалява, заради увеличаването на времетраенето на лаг фазата. От посочените данни може да се заключи, че оптималната глюкозна концентрация е 300 g/l. Повишаване добива на еритритол чрез контролиране концентрацията на глюкоза при полунепрекъснат процес. При полунепрекъснатия процес е поддържана концентрация на глюкоза 300 g/l, заради показаната при периодичния процес тенденция за максимална производителност при тази концентрация. Помпата за подаване на глюкоза е включвана при спадане на концентрацията й под 225 g/l. Обемът на хранителната среда се увеличава от 2,4 на 3 l, чрез постоянно подаване на 0,6 l глюкоза с концентрация 80%. Така в крайна сметка е достигната обща концентрация на глюкоза от 400 g/l (фигура 5). За достигане концентрация на еритритол от 40 g/l, с използване на допълнително подхранване са необходими 29 часа, при концентрация на глюкозата от 400 g/l, докато при периодично водене на процеса са необходими 58 часа, при същата концентрация на глюкоза (фиг. 6). При полунепрекъснат процес се наблюдава достигане на 10 g/l клетъчна маса на 20-тия час, докато при периодичния са необходими 68. Също така при полунепрекъснатия се наблюдава по-къса лаг фаза, както и по-висок добив на продукта. Тези наблюдения предполагат, че е възможно подобряване на добива на еритритол чрез вариране на глюкозната концентрация в оптималните граници. Това може да стане само в относително тесни граници, защото при полунепрекъснатия процес, след 60 часа, се наблюдава забавяне на увеличаването на добива. Тъй като по-долу е разгледано влиянието на фитиновата киселина върху добива на еритритол, тук само ще засегнем този проблем. Влиянието на присъствието на фитинова киселина върху полунепрекъснатия процес е изследвано чрез добавяне на фитинова киселина в концентрация 3 g/l. Получени са следните резултати, обобщени в таблица 7. [3] Таблица 7 Влияние на вида на процеса върху производството на еритритол от Torula sp. Тип култивиране Клетъчна маса [g/l] Еритритол [g/l] μmax [1/h] Qp [g/(l*h)] Yp/s [g/g] Време [h] Периодично 18,0 193 0,032 1,43 0,48 135 Полунепрексънато 19,8 197 0,040 1,79 0,49 110 Полунепрексънато с допълнително количество фитинова киселина 24,1 192 0,042 2,26 0,48 85 Както се вижда от таблица 7, обемната производителност на еритритола при полунепрекъснато водене на процеса с допълнително количество фитинова киселина е с 58% по-висока от тази при периодичния процес [3,15]. За повишаване производителността на еритритола се използват различни добавки към хранителната среда. Показани са изследвания, проведени от колектив в състав Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim и Deok-Kun Oh върху влиянието на различни минерални добавки върху производителността на еритритола. Използваните дрожди са изолирани от 40% разтвор на захароза и са поставени в лабораторен ферментор, съдържащ хранителна среда, приготвена от глюкоза в концентрация 400g/l, дрождев екстракт с концентрация 20 g/l, както и йони на Mn и Cu. Експерименталната ферментация е проведена по следната схема: Самостоятелна колония от Torula sp. е инокулирана в тестова епруветка, с диаметър 20mm, съдържаща 5 ml хранителна среда при енергично разбъркване (250 rpm) за 48 часа. 5 ml от обема се пренасят в лабораторен ферментор от 500 ml, съдържащ 100 ml хранителна среда. Култивацията се извършва отново при температура 30 °С и при разбъркване със скорост 250rpm, за 24 часа. Получената култура се пренася в експерименалнен ферментор с обем 5l, съдържащ 3l от описаната хранителна среда. Температурата и pH се поддържат съответно 34° С и 5,5. Скоростта на разбъркване се поддържа в граници от 500 до 850 rpm, за да се осигури концентрация на разтворен кислород над 20%. Процесът е периодичен. Ензимен анализ: Клетките се отделят от средата чрез центрофугиране и се отмиват с разтовор съдържащ 1М Tris/HCl буфер (pH 7,8), 0,5 mM EDTA и 5 mM меркаптоетанол. Така отделените клетки се суспендират в буфер, съдържащ 20 mМ Tris/HCl (pH 7,8), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM дитиотреитол и 1 mM PMSF (фенилметансулфонил флуорид). Получената суспензия се подлага на смилане в стъклена мелница, с диаметър 0,5 mm. За измерване на активността на еритроз-редуктазата са използвани фотометрично измерване на окисление на NADPH при добавяне на D-еритроза. Анализът се осъществява чрез измерване намаляването на абсорбцията, при светлина с дължина на вълната 340 nm. Клетъчната маса се измерва по предварително построена калибрационна крива, отразяваща сухата клетъчна маса като производна на промяната на светлинната абсорбция при 600 nm. Съдържанието на протеини се определя по метода на Lowry, при стандарт от телешки серумен албумин. Концентрацията на еритритол се определя чрез ВЕТХ- с подвижна фаза- ацетонитрил/вода и рефракционен детектор. Влияние на минералните добавки върху получаването на еритритол. Към описаната по-горе хранителна среда се добавят допълнителни количества от следните йони Ca2+, Co2+, Cu2+, Cr3+, Fe2+, Mg2+, Mn2+, Mo2+, Ni2+, V4+ и Zn 2+. Изследванията са проведени при 34 °C, pH 5,5 и скорост на разбъркване250 rpm. Резултатът от добавянето им е показан в таблица 8. Както личи от показаните резултати, увеличеното количество CaCl2.7H2O, CrCl3.6H2O, NiSO4.6H2O и VCl4 намаляват производителността по отношение на еритритола, докато малки количества от CuSO4.5H2O и MnSO4.4H2O я подобряват. При тестове с използването на CuCl2, CuCl и други медни съединения се наблюдават същите резултати, както при използването на CuSO4.5H2O. Оптималната концентрация на CuSO4.5H2O и MnSO4.4H2O е съответно 10 и 2 mg/l. Мангановите и медните съединения проявяват синергизъм- т.е. едновременното използване на двата вида йони води до достигане на по-високи концентрации еритритол, от колкото при използване на двата вида йони води до достигане на по-високи концентрации еритритол, от колкото при използването на всеки от тях самостоятелно. При едновременното добавяне на 10g/l CuSO4.5H2O и 2g/l MnSO4.4H2O е постигната концентрация на еритритол от 61,0 g/l (не е показано в таблицата). Таблица 8 Влияние на добавянето на някои минерали върху производството на еритритол от Torula sp. Минерал [mg/l] 0 1 2 5 10 20 50 100 250 Еритритол [g/l] Контрола 46 CaCl2.2H20 47 46 46 46 45 45 42 36 CoS04.7H20 45 43 42 42 45 46 46 46 CrCl3.6H20 46 44 42 39 40 40 4 0 CuSO4.5H20 51 54 45 45 33 29 23 18 FeSO4.7H20 47 47 47 47 46 45 46 47 MgSO4.7H20 46 46 47 46 47 46 46 47 MnSO4.4H20 46 46 50 54 49 43 34 26 NaMoO4.2H20 46 47 46 47 45 43 47 47 NiSO4.6H20 47 45 44 46 27 4 1 0 VCl4 46 46 47 47 33 15 1 0 ZnSO4.7H20 46 45 46 46 45 44 44 45 За изследване съвместното влияние на Mn2+ и Cu2+ върху производителността на еритритол в детайли, към 4 ферментора съдържащи по 400 g/l глюкоза и 20 g/l дрождев екстракт се добавят следните количества йони- в контролата- не се добавят, в първия- 10 mg/l MnSO4.4H2O, във втория- 2 mg/l CuSO4.5H2O и в последния- както 10 mg/l CuSO4.5H2O, така и 2mg/l MnSO4.4H2O. Консумацията на глюкозата и промяната на клетъчната маса в хода на ферментацията са показани на фигура 7. В първите 70 часа няма същественаразлика между културите (т.е. йоните не оказват влияние върху ферментацията). В следващите часове те започват да влияят- консумацията на глюкоза е най-ниска при контролната култура и съответно най-висока при културата съдържаща едновременно Cu2+ и Mn2+. При тази култура и пълната консумация на глюкоза настъпва най-бързо, докато в контролата глюкозата не се консумира до край в рамките на 150 часа. Допълнителните количества минерали подчертано подобряват и производителността на еритритола (фигура 8). И тук, както при предходната графика личи, че действието на добавките се проявява след 70-тия час. Но след 70 часа разликите стават още по-видими. Крайната концентрация на еритритол в контролата достига 155 g/l, за 144 часа. При добавянето на Mn2+концентрацията на продукта достига 174 g/l, а при използването на Cu2+- 178 g/l (на 138-я час). Най висока концентрация се наблюдава при едновременното добавяне на Cu2+ и Mn2+- 196 g/l за 135 часа. Специфичната обемна производителност на еритритол от глюкоза е 1,08 g/(l*h). При използването на добавки тя се увеличава до 1,21 и 1,29 g/(l*h), при използването съответно на Cu2+ и Mn2+ поотделно и до 1,45 g/(l*h) при съвместното използване на двата йона. Добавянето на Cu2+ и Mn2+ влияе върху активността на ензима еритрозо редуктаза и върху концентрацията на вътреклетъчния еритритол, както е показано в таблица 9 (изследванията са проведени върху проби, взети на 137-я час от културите, използвани при изследването на продуктивността, при добавяне на Cu2+ и Mn2). Концентрацията на извънклетъчен еритритол се понижава при добавянето на Mn2+, докато добавянето на Cu2+ не оказва влияние върху нея. Това доказва твърдението на Wang[18]- повишената концентрация на Mn2+ влияе върху клетъчната пропускливост. Ензимната активност на еритрозо редуктазата се влияе от допълнителните количества Cu2+, но не и от Mn2+. При едновременното добавяне на Cu2+ и Mn2+ се повлиява както ензимната активност, така и клетъчната пропускливост, което води до по-добри резултати при едновременното добавяне на Cu2+ и Mn2+ [7,8,9]. Таблица 9 Влияние на добавянето на Cu2+ и Mn2+ йони върху производството на еритритол от Torula sp. и върху активността на ензима еритрозо редуктаза Добавка Концентрация на вътреклетъчен еритритол [g/l] Концентрация на извънклетъчен еритритол [g/l] Еритрозо редуктазна активност [u/mg] Без (контрола) 1,5 147 0,35 Cu2+ 0,9 171 0,36 Mn2+ 1,5 178 0,47 Cu2+ и Mn2+ 1 196 0,47 За подобряване производителността се използва добавянето и на различни органични съединения- витамини и др. Показано е влиянието на различни витамини върху процеса на получаване на еритритол. Опитните данни се базират на изследване по темата, направено от Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim и Deok-Kun Oh. Използваните дрожди се изолират от 40% разтвор на захароза и се поставят в хранителна среда (за първично култивиране) съдържаща 10 g l-1 дрождев екстракт, 200 g l-1 глюкоза и по 0,5 mM инозитол и фитинова киселина. За експерименалния ферментор се използват 20 g l-1 дрождев екстракт, 400 g l-1 глюкоза и по 0,5 mM инозитол и фитинова киселина, както и някои други витамини. В таблица 10 е показано влиянието на концентрацията на витамините върху дрождите. Експерименталната ферментация се провежда по следната схема: Самостоятелна колония от Torula sp. се инокулира в тестова епруветка, с диаметър 20mm, съдържаща 5 ml хранителна среда при енергично разбъркване (250 rpm) за 48 часа. 5 ml от обема се пренасят в лабораторен ферментор от 500 ml, съдържащ 100 ml хранителна среда. Култивацията се извършва отново при температура 30 °С и при разбъркване със скорост 250rpm, за 24 часа. Получената култура се пренася във ферментор от 5 l, съдържащ 3 l хранителна среда при температура 34 °С и pH 5,5. Скоростта на разбъркване се поддържа в граници от 500 до 850 rpm, за да се осигури концентрация на разтворен кислород над 20%. Процесът е периодичен. Таблица 10 Влияние на концентрацията на някои витамини върху производството на еритритол от Torula sp. Витамин [mg/l] 0 1 5 10 25 50 100 200 Еритритол [g/l] Контрола 46 Биотин 46,6 35,8 14,6 5 - - - Калциев пантотенат 45,2 43,1 42,1 41,6 36,2 15,8 - Фолиева киселина 46,4 43,8 40,1 24,1 - - - Инозитол 45,3 45,6 46,2 49,3 53,8 56,6 38,9 Ниацин 46 46,8 47,1 47 46,3 34,8 11,4 p-аминобензоена киселина 46,3 46,4 46,8 46,1 40,2 16 - Пиридоксин хидрохлорид 46,1 48,4 50,5 46,6 31,8 12,6 - Рибофлавин 45,4 45,3 35,8 27 15,3 3,1 - Тиамин 46,7 45,4 44,3 46,2 26,8 3,6 - Ензимен анализ Клетки от получената култура се центрофугират 10 минути, при 8000 g. След измиване със смес от 0,1 M Tris/HCl буфер (поддържащ pH 7,8), 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 1 mM дитиотреитол и 1 mM фенилметилсулфонилфлуорид, получената суспензия се подлага на смилане в стъклена мелница, с диаметър 0,5 mm. За измерване на активността на еритроз-редуктазата се използва фотометрично измерване на окисление на NADPH при добавяне на D-еритроза. Анализът се осъществява чрез измерване намаляването на абсорбцията, при светлина с дължина на вълната 340 nm. Методът е разработен от Chang & Knight, през 1966, за измерване на ензимната активност на ксилозо-редуктазата. Резултатите са посочени в таблица 11. Таблица 11 Влияние на добавянето на някой фосфорни съединения върху производството на еритритол от Torula sp. и върху еритритозо-редуктазната активност * Една единица ензимна активност се дефинира като количеството ензим, катализирал окислението на 1 μmol NADPH за минута. Данните са усреднени на база на 5 самостоятелни измервания. Влияние на витамините върху производството на еритритол Посочените в таблица 11 витамини са добавени в указаните количества към среда съдържаща 200 g/l глюкоза и 10 g/l дрождеви екстракт. При оптимална концентрация на биотин, фолиева киселина, ниацин, p-аминобензоена киселина и тиамин, в средата, промяната на концентрацията на получения еритритол (в сравнение с контролата) е незначителна. От друга страна добавянето на калиев пантотенат и рибофлавин оказва негативно влияние на продуктивността. От трета страна инозитолът и пиридоксин хидрохлоридът повишават производителността. Най-ефективен от всички витамини е инзоитолът- с добавяне на инозитол до концентрация 100 mg/l се достига концентрация на еритритол от 56,6 g/l, т.е. с 23% по- висока от тази в контролата. За допълнително повишаване продуктивността на процесът се добавят допълнителни количества инозитол, както и подобни компоненти- фитинова киселина. Както се вижда от таблица 11, количеството на получения еритритол е по-високо при добавянето на фитинова киселина, отколкото при използване на инозитол. За да се установи влиянието на фосфатния остатък, внесен с киселината, върху продуктивността на метода се добавя KH2PO4 като източник на PO43-. Добавянето му повишава скоростта на растеж, количеството получен еритритол, както и активността на еритрозо редуктазата. Както се вижда от таблицата продуктивността се повишава при използване на фитинова киселина, в сравнение със сместа KH2PO4-инозитол.За да се установи ефектът от добавянето на инозитол и фитинова киселина върху производителността на еритрола в детайли, се използват различни количества от двете вещества. Практическият опит се провежда във ферментор. Изполвани са четири култури- контролна- в хранителната среда не са добавени инозитол и/ или фитинова киселина, култура с допълнително количество KH2PO4 , таквава с KH2PO4 и инозитол и култивира с фитинова киселина. На фигура 9 са показани консумацията на глюкоза и растежът на клетките на всяка от споменатите култури. Консумацията на глюкоза е по-бавна при контролата, в сравнение със съдържащите фосфат и инозитол. По-бърза консумация на глюкоза се наблюдава при култивиране на среда съдържаща повишени количества фосфат и инозитол (или фитинова киселина на мястото на инозитола) е по-висока от тази на съдържащите фосфат. Изводът е, че инозитолът е по-ефективен стимулатор на консумацията на глюкоза, отколкото е фосфатът. Глюкозата напълно се изразходва в култури съдържащи фитинова киселина, докато при съдържащите фосфат и смес от фосфат и инозитол времето за напълно изразходване на глюкозата е приблизително еднакво. Има значителна разлика в растежа на клетките в зависимост от наличието на инозитол. Културите култивирани на среда съдържаща инозитол имат по-висока концентрация на клетките, от където можем да заключим, че инозитолът стимулира растежът на Torula sp. Присъствието на инозитол и фитинова киселина подчертано засилва продуктивността. Както може да се види от фигура 10, разликите между културите, култивирани на среда, в която присъства инозитол и такава на която отсъства, са незначителни в първите 70 часа, но ясно изразени след това. След проведените опити са постигнати следните резултати: - концентрацията на глюкоза в контролата от 155 g/l, след 144 часа или обемна производителност от 1,08 g/(l*h) - концентрацията на глюкоза при използване на допълнително количество KH2PO4 -158 g/l, след 144 часа или обемна производителност от 1,21 g/(l*h) - концентрацията на глюкоза при използване на допълнителни количества KH2PO4 и инозитол- 178 g/l, след 135 часа или обемна производителност от 1,32 g/(l*h) - концентрацията на глюкоза при използване на допълнително количество фитинова киселина- 182 g/l, след 135 часа или обемна производителност от 1,35 g/(l*h) От посочените данни можем да се направи следният извод- инозитолът, както и фосфатите стимулират растежа, както и производителността по отношение на еритритола, като инозитолът е по-ефективният от двата. При промишленото приложение на хранителната среда се препоръчва добавянето на допълнителни количества фитинова киселина към хранителната среда. [8,16,17] III. Заключение В резултат на направения литературен обзор върху методите за получаване на еритритол, поради предимствата на микробиологичните методи предлагаме следната блок схема за получаване на еритритол. За прилагане на предложената блок-схема в производството ние предлагаме следната хранителна среда: Въглероден източник-глюкоза с концентрация 400 g/l Азотен източник- дрождев екстракт с концентрация 20 g/l Помощни вещества: Минерални вещества- 10 mg/l CuSO4.5H2O и 2mg/l MnSO4.4H2O Витамини- 0,5 mM фитинова киселина Препоръчваме ферментацията да се провежда при аеробни, стерилни условия, при постоянно разбъркване и атмосферно налягане. Температурата да се поддържа 34° С, pH-то 5,5. IV. Литература 1)Иванов Д., Органична химия, изд. Наука и изкуство, София, 1967 2)Corti A, Low-calorie sweeteners: present and future : World Conference on Low-Calorie Sweeteners, 1999 3)D-K Oh, C-H Cho, J-K Lee and S-Y Kim, Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 26: 248-252, 2001 4)Fugelsang K. C., Charles G. Edwards, Wine microbiology: practical applications and procedures, 2007 5)Grenby, Trevor H. Advances in sweeteners- , 1996 6)Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim & Deok-Kun Oh, Biotechnology Letters 22: 983-986, 2000 7)Jung-Kul Lee, Suk-Jin Ha, Sang-Yong Kim & Deok-Kun Oh, Biotechnology Letters 23: 497-500, 2001 8)Kim KA, BS Noh, Kim SY, Oh DK, Appl. Microbiol. Biotechnol. 27: 91–95, 1999 9)Kim KA, BS Noh, Kim SY, Oh DK Biotechnol. 10: 69–74, 2000 10)Metzl eE., Biochemistry The Chemical Reactions Of Living Cells 2d Ed Vols 1&2, 2007 11)Onishi H . Japan Ferment. Technol. 25: 495–506,1967 12)Owusu-Apenten, Richard,Introduction to food chemistry- 2005 13) Park JB, BC Seo, JR Kim and YK Park, J Ferment Bioeng 86: 577-580, 1998 14)Shallenberger, R.S., Taste chemistry, 1993 15)Shindoh T, Y Sasaki, H miki, T Eguchi, K Hagiwara and T Ichikawa, Agric Food Chem 37: 1474-1476, 1989 16)Shindoh T, Y Sasaki, H Miki, T Eguchi, K Hagiwata and T Ichikawa, Nippon Nogei Kagaku Kaishi 62: 623-626, 1988 17)Shindoh T, Y Sasaki, H Miki, T Eguchi, K Hagiwata and T Ichikawa, Shokuhin Eiseigaku Zasshi 29: 419-422, 1988 18)Wang et al., Fermentation and Enzyme Technology, 1979 19)Warren S., J Clayden, N Greeves and P Wothers, Advanced Organic Chemistry, 2000 20)http://www.dld123.com/sweetsavvy/sweeteners/summary.php?id=Sugar%20Alcohols 21)http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/securit/addit/sweeten-edulcor/polyols_polydextose_factsheet-polyols_polydextose_fiche-eng.php 22)http://www.stb.tsukuba-ac.jp 23)http://www.thefreelibrary.com/EU+recognizes+Zerose+erythritol+as+a+zero-calorie+sweetener.-a0199464716 24)http://www.yeastgenome.org Final.doc

Мерси, вече пробвах, но няма. На компа имам някакви руски, но съответно са с Руските стандарти. П.П. Мерси все пак. П.П.2 А да се сещаш къде да публикувам руските?

Здравейте, случайно видях вашия форум и искам да ви помоля за помощ. На някой да му се намира он-лаин ръководство по процеси и апарати, или някаква информация за стандартните размери на изпарителните инсталации? Предварително благодаря. П.П. Плащам в бира.