РАЗДЕЛ 2 ГЕНОМИ
13 ГЕНОМИ
2.1. Хромозоми
2.1.1. Прокариотни и еукариотни хромозоми
Всички живи клетъчни форми имат структури, които носят гените, кодирани от ДНК, наречени хромозоми. Въпреки общия термин, съществуват значителни различия между прокариотните хромозоми и дори тези на най-простите еукариоти. При прокари-отите хромозомите се състоят от една двойноверижна ДНК, която е обикновено пръс-теновидна и има сравнително малко белтъци, свързани с нея. Репликацията на тази ве-рига става от едно начало на репликация (origin), както бе описано по-рано (вж. раздел 1.9). В повечето случаи еукариотните организми имат множество хромозоми, които са линейни и са локализирани в мембранния органел – ядрото. В тези хромозоми молеку-лата ДНК е тясно асоциирана с голямо количество специфични белтъци, които могат да имат структурна или функционална роля. Количеството на ДНК в еукариотните хромо-зоми е многократно по-голямо от това в прокариотните. По-тази причина репликацията в тях започва в множество начални места.
2.1.2. Морфология на хромозомите
Еукариотните хромозоми са обикновено видими само в определени периоди на делене на клетката (вж. раздели 2.2 и 3.3), след като хромозомите са се реплицирали в специални двойни структури, наречени хроматиди (дъщерни хромозоми). Хромозомите се класифицират на базата на тяхната морфология, а тя се определя от мястото на цен-тромера (първичното прещъпване). На Фиг. 2.1 са показани няколко типични структу-ри на хромозоми. При метацентричните (медиоцентрични) хромозоми центромерът е близо до средата на хромозомата. Това разде-ля хромозомата на две сравнително равни части – рамене. Когато центромерът е на зна-чително по-голямо разстояние от средата, при което се формират две рамена – дълго (q-рамо) и късо (p-рамо), хромозомите се озна-чават като субметацентрични. При другите два класа центромерът е много близо до еди-ния край на хромозомата. При телоцентрич-ните хромозоми центромерът е в единия край на хромозомата, при което се наблюдава само едно рамо. Ако центромерът е толкова близо до края, че рамената са едва забележими, хромозомите се наричат акроцентрични. Двата последни типа могат лесно да се обър-кат. Разликата между тях се забелязва лесно върху човешките хромозоми (Фиг. 2.2).
Пълният диплоиден набор хромозоми при всеки вид се нарича кариотип. Хромо-зомите се подреждат по намаляваща големина и се разделят на полови хромозоми (X и Y) и аутозоми (всички останали; вж. раздел 3.8). Хромозомите могат да се фотографи-рат и хомоложните хромозоми да се подредят по двойки и по ред. Това се означава като идеограма и е обикновеният начин за показване на кариотипа.
Чрез подреждането на хромозомите по големина и морфология е възможно да се идентифицира всяка индивидуална хромозома в кариотипа. Този процес е направен значително по-лесен с прилагане на специални процеси на третиране преди багрене. Това дава поредица тъмни и светли зони, уникални за всяка хромозома. Този начин на изследване се нарича бендинг (banding, от band – ивица, зона). Макар, че съществуват множество способи, най-широко използвани са т. нар G-бендинг и С- бендинг.
G-бендинг може да се постигне с множество третирания, но най-широко се из-ползва предварително третиране на препаратите с хромозоми с протеолитични ензими, като например трипсин. Така обработените препарати се багрят по Giemsa (оттам про-излиза и името G-бендинг). Това третиране дава тъмни ивици и по-светли интервали. Наборът светли и тъмни зони е уникален за всяка хомоложна хромозомна двойка и по-мага изключително много за идентифициране на хромозомите. Тези набори са използ-вани за съставяне на цитологични карти на всяка хромозома при много видове, при ко-ето могат точно да се дефинират и субхромозомни области. Това е особено важно за картиране на гените и в медицинската генетика (Глава 13).
На фиг. 2.2 може да се види диаграма на G-бендинг зоните на всяка човешка хро-мозома. Този набор позволява всяка отделна хромозома да се раздели на области и по-добласти. Ако се използва хромозома 1 като пример, първото делене се прави между двете рамена (q и р). По-нататък се вижда, че q-рамото се дели на области 1, 2, 3 и 4. Има още две допълнителни нива на разделяне, така че една специфична област може да се дефинира с означението 1.q.42.1. Трябва да се отбележи, че не всички хромозоми и дори хромозомни области са разделени еднакво. Тези области са субективни и са дефи-нирани със специални конвенции на цитогенетиците. Като се има предвид, че подобни багрения могат да се прилагат и на по-дълги и на по-малко кондензирани хромозоми, броят на суб-регионите може да се увеличи значително. G-бендингът не само дава удо-бен начин за идентифициране на хромозомите, но и говори за общата организацията на ДНК и гените в еукариотните хромозоми. Като цяло тъмните зони са по-богати на ба-зите аденин и тимин, а по-светлите на гуанин и цитозин. Повечето гени са локализира-ни по-скоро в интервалите, отколкото в G-зоните.
С-бендингът също дава информация за организацията на хромозомите. Той дава определен брой тъмни зони, които са обикновено около центромерите. Те показват об-ластите на конститутивния хетерохроматин, които ще бъдат разгледани подробно по-късно.
2.1.3. Специализирана организация на хромозомите
Всички еукариотни хромозоми имат две специфични области с особено структур-но значение. Това са центромерите и теломерите. В допълнение някои хромозоми имат област на ядърцевия организатор (nucleolar organizer region - NOR). Центроме-рите са местата, където делителното вретено е свързано с хромозомите по време на де-лене на клетката и функционалните центромери са важни за този процес. Всеки хромо-зомен фрагмент, който загуби връзката си към центромера няма да се сегрегира в дъ-щерните клетки в края на клетъчното делене. Най-добре са проучени центромерите при дрождените хромозоми, някои от които са доста къси (до 200 нд), но повечето центро-мери са доста по-дълги. Обикновено центромерите се състоят от често повтарящи се фрагменти от сателитна ДНК (вж. раздел 2.4). При хората различните хромозоми могат да се отдиференцират по наличието на специална алфовидна сателитна ДНК в центро-мерите. Връзката между хромозомата и микротръбиците на делителното вретено се осъществява чрез специални белтъци, които са свързани с центромера и образуват мно-гослойна структура, наречена кинетохор.
Теломерите не са просто краищата на хромозомите и ДНК молекулите, а са спе-циализирани структури. Те съдържат множествени повторения на секвенции като TTAGGG. Няма обаче голяма специфика в различните организми – подобни секвенции са открити и в растения и в първаци. Към теломерните области се свързват специфични белтъци и се предполага, че получените нуклеопротеидни структури предотвратяват рекомбинацията между краищата на различните хромозоми. Броят на повторенията в теломерите е висок в младите делящи се клетки и постепенно намалява с възрастта на соматичните тъкани, поради което може да се счита, че това е молекулен маркер на процеса стареене. Дължината на теломерите се регулира от ензима теломераза, който съдържа фрагменти РНК, комплементарни на повторенията от ДНК, а те играят роля на матрици за удължаване на теломерите. Теломеразата липсва в соматичните клетки, но се появява отново в туморните клетки, където дължината на теломерите се стабилизи-ра.
NOR се откриват обикновено в т. нар. вторични прещъпвания. Те се състоят от тандемно повторени гени за рибозомните гени за 5,8S, 18S и 28S (вж. 1.6). В повечето организми гените за 5S рРНК са локализирани на други места в генома. В човешкия ге
ном NOR са локализирани на късите рамена на всички алоцентрични хромозоми, с изк-лючение на Y хромозомата. Всеки NOR се състои от около 80-100 повторения. По вре-ме на интерфазата NOR се декондензира и около него отново се организира ядърце, при което NOR от различните хромозоми се обединяват в едно ядърце. Когато клетката навлезе в метафазата на митотичното делене, хромозомите могат да се окажат все още свързани с късите си рамена, което е известно като сателитна асоциация.
Вторичното прещъпване може да е толкова силно изразено, че една малка дистал-на част от хромозомата изглежда почти отделена от нея и се нарича хромозомен сате-лит. При човека те могат да се видят на хромозоми 13, 14, 15 и 21 (Фиг. 2.2). Хромо-зомният сателит не бива да се бърка със сателитната ДНК (вж. 2.4).
2.1.4. Молекулярна структура на хромозомите
Хромозомите са съставени от ДНК и белтък. Може да има и малко количество РНК, която обаче няма функционална роля в тях. Сместа от ДНК и белтък се нарича хроматин. Белтъците се делят на два класа – хистонови и нехистонови или кисели белтъци, като и двата типа играят важна роля в структурата и функцията на хромозоми-те. Хистоните са група малки белтъци с молекулна маса под 23 kD. Като съотношение те са равни на количеството на ДНК в хромозомите. При физиоло-гично pH те има положителен за-ряд, който се дължи на големия процент базови аминокиселини ка-то аргинин и лизин. Този заряд по-мага за стабилната връзка с полиа-ниона ДНК. Установени са пет различни хистона Н1, Н2а, Н2b, H3 и Н4. Това се отнася до всички ор-ганизми и тъкани, с малки изклю-чения по отношение на Н1. Ами-нокиселинната секвенция на всеки хистон е високо-консервативна от еволюционна гледна точка, което показва, че тези молекули имат го-лямо значение, критично за прежи-вяването на еукариотите. Този факт е обяснен с откриване на нуклеозомите – основната градив-на единица на хроматина.
Нуклеозомите се състоят от ядро, изградено от хистони, около което се увива веригата на ДНК. Ядрото се състои от два успоредни диска, образувани от по четири хистона - Н2а, Н2b, H3 и Н4. ДНК е разположена по ръбовете на цилиндъ-ра, образуван от дисковете. Хистонът Н1 се намира отвън на цилиндъра и фиксира на-вивките на ДНК. В нуклеозомата участва ДНК с дължина 146 нд. Участъкът от свърз-ващата ДНК между две нуклезоми се нарича линкер и варира в различните видове, но при човека е около 60 нд, което дава обща дължина на ДНК в една нуклеозома около 200 нд. Това е основното ниво на пакетиране на ДНК в хроматина. По-нататъшното па-кетиране в голяма степен зависи от хистона H1. Молекулите Н1 могат да си взаимо-действат и да организират нуклеозомите в спирална структура (solenoid) с диаметър 30 nm. Това е диаметърът на нишката, която най-често се вижда на електронните микрог рафии на хроматина, но са открити и някои по-плътно опаковани структури. Една прос-та структура на соленоид е представена на фиг. 2.3. В ядрото се наблюдават и структу-ри с по-висока степен на кондензация. Най-висока плътност се наблюдава в хромозо-мите по време на метафазата на клетъчното делене. Организирането на тези структури представлява свързване на хроматиновите нишки към скелета на хромозомата. Основна роля в това играе киселият ядрен белтък, топоизомераза II. Има специфични области на ДНК с дължина неколкостотин нуклеотидни двойки, богати на базите аденин и ти-мин, които са известни като области за свързване със скелета (scaffold attachment regions, SARs), и които свързват нишките ДНК със скелета. Веригите ДНК между тях са организирани като бримки с различна дължина. ДНК от тези област може да се види ако се премахнат хистоните в препарати от метафазни хромозоми. Тогава електронните снимки показват бримките, излизащи от скелета на хромозомите. Нехистоновите ядре-ни белтъци участват по различен начин във функционирането на хроматина като нап-ример регулация на генната експресия, където транскрипционните фактори играят съ-ществена роля. По-подробно тези процеси са разгледани в раздел 2.11.
2.1.4. Функционален и нефункционален хроматин
Не всички области на хроматина участват еднакво в транскрипцията на гените. Известна част от хроматина е функционално неактивна. Тази част е известна като хете-рохроматин, за разлика от функционално-активната му част – еухроматин. Както се вижда от електронно-микроскопските снимки хетерохроматинът има по-плътно опако-вана структура на хроматиновите нишки. Той може също така да се отдиференцира и с багрене на светлинна микроскопия. Част от хроматина е хетерохроматин във всички тъкани и всички етапи на развитие на клетката, нарича се конститутивен хроматин и може да се открие чрез С-бендинг. Както беше споменато по-горе със С-бендинг се от-криват центромерите. В тези области има здраво свързване на ДНК и белтък, което на-малява загубата на ДНК при обработката за С-бендинг, поради което тези области се багрят по-интензивно. Други области с конститутивен хроматин има в дългото рамо на човешката Y-хромозома и в области на половите хромозоми на някои животни. Подоб-ни С-зони се срещат по-често при растенията, където те се използват за идентифицира-не на хромозомите, тъй като при растителните хромозоми не се наблюдава G-бендинг.
Някои области на хроматина могат да съществуват или в хетерохроматиново или в еухроматиново състояние. Такива области се наричат факултативен хетерохрома-тин. Женските бозайници имат две Х-хромозоми, като едната е неактивна по отноше-ние на транскрипцията. Тя се превръща в хетерохроматин и се наблюдава като малка плътна точка в интерфазното ядро, известна като телце на Бар или Х-хроматин. По този начин се осъществява компенсация в броя на експресираните гени с мъжките ин-дивиди, които имат само една Х-хромозома и една Y-хромозома, която също се състои основно от хетерохроматин. Коя от двете Х-хромозоми ще се инактивира е случаен процес. При около половината от женските екземпляри се инактивира Х-хромозомата с произход от мъжкия родител, а при другата половина – от женския. Инактивираната Х-хромозома се реактивира по време на гаметогенезата.
2.1.5. Аберации в броя на хромозомите
Промяна в броя на хромозомите може да се получи при грешки по време на мейо-зата, процес, свързан с гаметогенезата (3.3). В резултат на това се получават гамети със загуба или излишък на генетичен материал. Ако гаметите са жизнени те ще дадат по-томство със същата абнормална конфигурация на хромозомите. Грешки, които стават по време на митозата (вж. раздел 2.2) дават поколение с повече от един кариотип. Та-кива индивиди се наричат мозаечни, тъй като хромозомни аберации има само в опре-
делени участъци, които са изградени от поколенията на клетката, в която е станала абе-рацията.
Полиплоидия се получава тогава, когато броят на хромозомите се увеличава или намалява с число, кратно на хаплоидния набор. Еуплоидните серии показват различни плоидни нива. Един пример за човешкия геном е даден в Табл. 2.1. Триплоидите и тет-раплоидите представляват около 10% от спонтанните аборти и никога не се наблюдават при живи деца. Полиплоидията е рядка в животинското царство, но се среща често при растенията, при които е важна за еволюцията. Много от важните културни растения са полиплоиди. Обикновено при тези растенията се наблюдава по-голяма продуктивност, на базата на многото копия гени.
Таблица 2.1. Човешки еуплоидни серии
Брой хромозоми Плоидност Нормално се открива в
23 Хаплоид Тетраплоид
46 Диплоид Соматични клетки
69 Триплоид
96 Гамети
Анеуплоидията се отнася до случаи, при които се наблюдават малки отклонения в хромозомните от еуплоидния набор. Нулизомията е липса на едно копие от опреде-лена хромозома. Като дизомия се означава наличие на две копия на хромозомата, а при тризомията има три копия. Монозомията е нормална при гаметите, дизомията е харак-терна при соматичните, диплоидни клетки. На табл. 2.2 са представени случаи на ане-уплоидия при човешкия хромозомен набор.
Таблица 2.2. Анеуплоидии в човешките популации
Състояние Участващи хромозоми Приблизителна честота
Допълнителна аутозомна 18 1 на 5 000
хромозома 13 1 на 5 000
Синдром на Едуард 21 1 на 750
Синдром на Пато XO 1 на 10 000
Сндром на Даун ХXY 1 на 2 000
Анеуплоидия на полова хромозома XXX 1 на 2 000
Синдром на Търнър
Синдром на Килфелтер
Синдром на тройна Х хромозома
Установена е анеуплоидия и за някои други гени, освен посочените, но само в за-родиши от спонтанен аборт. Като цяло се счита, че около 4% от човешките аборти са резултат на тризомия. При зародиши, които при този дефект оживяват, се предполага сравнително кратко време на живот. Индивиди, при които има тризомия само по част от хромозомата проявяват отрицателните признаци значително по-слабо. Тук трябва да се отбележи, че в този смисъл аутозомните тризомии, отбелязани по-горе, се отнасят до малките хромозоми. Присъствието на допълнително копие от една голяма хромозома вероятно ще доведе до експресия на прекалено много гени, за да се развие зародиш.
Анеуплоидия на полови хромозоми е сравнително често явление, въпреки, че Х-хромозомата спада към големите хромозоми, носещи много гени. Как може да се обяс-ни това? Както беше отбелязано по-рано, само едната Х-хромозома е активна по отно-шение на транскрипцията, така че присъствието на още една хромозома има по-малък ефект, отколкото бихме могли да предположим. Синдромът на Търнър (ХО) е по-рядък от другите полови анеуплоидии и често се среща като мозайка, където е смесен с (ХХ) клетки и това може да улесни преживяването.
Анеуплоидни гамети се получават от грешки при първото или второто делене на мейозата чрез един процес, при който се нарушава разделянето (nondisjunction). Това може да стане например когато две хомоложни хромозоми при мейоза 1 или центроме-рът не успее да се раздели при метафазата на мейоза 2. (вж. раздел 3.3). Подобен процес при центромера може да се получи и при митозата. Счита се, че неразделянето възник-ва като спонтанен процес, подобен на мутациите в секвенцията на ДНК, но все пак се влияе от някои външни фактори. Това се вижда ясно при тризомията на хромозома 21, където случаите се увеличават с възрастта на майката. В някои случаи има семейна предразположеност към тризомия 21, поради наличието на носители в семейството, ко-ито имат нормален фенотип, но имат транслокация на хромозома 21. Те могат да пре-дадат на поколението си или нормалното копие на хромозома 21 или транслокация, ко-ято също съдържа хромозома 21. Засегнатото дете унаследява и нормално копие на хромозома 21 от другия родител и така ще има три копия от хромозомата. Това е опи-сано на Фиг. 2.4.
Носител Нормален Резултат
21, 14 21, 14 Жизнен, нормален
21/14 21, 14 Жизнен, носител
21, 21/14 21, 14 Тризомия 21
14 21, 14 Летален нулизомик
14, 21/14 21, 14 Не жизнен
21 21, 14 Летален нулизомик
Фиг. 2.4. Унаследяване на тризомия 21 (Синдром на Даун). Ако индивидът е носител на три-зомия 21, поради наличие на транслокация между хромозома 21 и хромозома 14, ще се получат ге-нетично различни гамети в резултат на неравномерната сегрегация на транслокацията при мейо-зата. Тези гамети ще се оплодят от нормални гамети, монозомни за хромозоми 21 и 14. Двете гру-пи гамети и резултатът на тяхното сливане са показани по-горе. Транслокацията е означена като 21/14. Трябва да се отбележи, че честотата на получаване на различни гамети не еднаква.
Всички описани синдроми, с изключение на синдромът на Търнър (ХО), показват наличие на една допълнителна хромозома. Индивиди със загуба на една хромозома, или монозомици, са много редки и имат много кратък живот. При човека нулизомиците ни-кога не са жизнеспособни. При растенията нещата са много различни. Там има много мутанти-нулизомици, които са жизнени и освен това се използват при контролни кръс-тоски с цел характеризиране на генома.
2._________2.1__________.doc
