МОЛЕКУЛЯРНА ГЕНЕТИКА

[ROCK]

....

Редактирано Ноември 23, 2008 от ROCK

[ROCK]

РАЗДЕЛ 1 Структура на ДНК

1. МОЛЕКУЛЯРНА ГЕНЕТИКА

1. 1. Структура на ДНК

1.1.1. Нуклеотиди

Способността на ДНК да носи генетична информация, необходима за възпроиз-веждане на клетките, е тясно свързана със структурата на молекулата ДНК. ДНК е по-лимер, съставен от дълга верига мономери, наречени нукле-отиди, поради което молекулата на ДНК се означава като полинуклеотид. Всеки нуклеотид има три части – един моно-захарид, азот-съдържаща пръстеновидна структура, наречена база и фосфатна група. Монозахаридът, представен в ДНК е петвъглеродна пентоза, наречена 2’-дезоксирибоза, в която хидроксилната група (-ОН) при втория въглероден атом (2’-С) е заместена с водород (Фиг. 1.1). Въглеродните атоми в пентозата са номерирани от 1 до 5. Всеки номер се означава с ‘ (прим), за да се различават от номерацията в азотната база. Номерирането е важно, за да може да се означи свързването на останалите компоненти с пентозата.

Нуклеотидите съдържат една от четирите бази – аденин, гуанин, тимин и цито-зин (Фиг. 1.2). Това са съединения, съдържащи пръстен, изграден от въглерод и азот. Аденинът и гуанинът са изградени от двоен въглеродно-азотен пръстени, и се наричат пурини. Цитозинът и тиминът представ-ляват еднопръстенни съединения – пири-мидини. Азотните бази са свързани с пен-тозата чрез връзка между първия въглеро-ден атом на пентозата (1’) и азотът в по-ложение 9 - в пурините и положение 1 - в пиримидините. Тази връзка се означава като N-глюкозидна връзка. Пентозата, свързана с азотната база се нарича нукле-озид (Фиг. 1.3 а).

Нуклеотидите съдържат фосфатна група (РО4), свързана с 5’-въглеродния атом на пентозата (Фиг. 1.3 б). Нуклеози-дът се превръща в нуклеотид, когато към него е свързана фосфатната група, като тук могат да се свързват една, две или три фосфатни групи. Тези групи се означават като α, β и γ, като α е пряко свързана с монозахарида. Нуклеотидите могат да съществуват в клетката или като индиви дуални съединения (нуклеотид трифосфатите играят важна роля при процесите на ме-таболизма на клетката, например АТФ) или като полимеризирали във веригата на нук-леиновите киселини (ДНК или РНК).

Фиг. 1.1. Структура на 2’-дезоксирибоза

Фиг. 1.2. Бази в ДНК

Фиг. 1.3. Структура на нуклезоид и нуклеотид

1.1.2. ДНК полинуклеотиди

Фиг. 1.4. Фосфодиестерна връзка

Нуклеотид трифосфатите се свързват един с друг и образуват полинуклеотидна верига. Четири от тях се използват за синтеза на ДНК – 2’дезоксиаденозин 5’-трифосфат (dATP, дАТФ или А), 2’дезоксигуанозин 5’-трифосфат (dGTP, дГТФ или G), 2’дезокситимидин 5’-трифосфат (dTTP, дТТФ или T) и 2’дезокси-цитозин 5’-трифосфат (dCTP, дЦТФ или C). Фосфатите β и γ се губят по време на полимеризацията и нуклеотидите се свър-зват с останалия α-фосфат. 5’-фосфатът на единия нуклеотид формира връзка с 3’С на другия нуклео-тид, който съдържа -ОН група. Тази връзка се на-рича 3’-5’ фосфодиестерна връзка (С-О-Р) (Фиг. 1.4). Полинуклеотидната верига има свободен 5’ фосфат на единия край, известен като 5’-край и свободна 3’ОН група на другия край, известен като 3’-край. Тази разлика осигурява полярност на по-линуклеотидната верига на ДНК, така че тя може да бъде ориентирана в посока 5’→3’ или в посока 3’→5’.

Всъщност последователността на нуклеоти-дите или тяхната секвенция е тази, която определя генетичната информация. Тази ин-формация е винаги ориентирана в посока 5’→3’ (полимеразните ензими копират ДНК винаги в тази посока). Полинуклеотидите могат да бъдат много дълги, като очевидно няма ограничение в броя на нуклеотидите и в тяхната секвенция. Максималният брой секвенции от една полинуклеотидна верига изградена от n нуклеотида може да се из-числи по формулата 4n, което означава, че един олигонуклеотид, изграден само от 6 нуклеотида може да съществува в 46 = 4096 варианта на различни секвенции, а един бактериален ген от около 1000 нуклеотида може да има почти неограничено разнообра-зие от секвенции – 4¹⁰⁰⁰, което е невъобразимо голямо число.

Редактирано Юни 25, 2007 от ROCK

[ROCK]

2 Двойната спирала

ДНК молекулите имат много типична и специфична триизмерна структура, извес-тна като двойна спирала (Фиг. 1.5). Моделът на двойната спирала е изграден през 1953 г. от Уотсън и Крик в Кембридж. Двамата са използвали основно данните от рентгеноструктурния анализ на кристали ДНК, направени от Уилкинс и Франклин. ДНК съществува като две единични вериги, увити една около друга, за да образуват двойна спирала. Захаро-фосфатната част на молекулата образува един скелет, който е разположен от външната част на двойната спирала. Азотните бази, които са плоски структури сочат навътре към центъра на спиралата и са разположени (стекирани) една над друга, формирайки сили на стекинг-взаимодействия помежду си.

Рентгеноструктурният анализ показва нали-чие на повтарящи се зони, което говори за перио-дично повтарящи се структури в ДНК. Двойната верига прави по един оборот на всеки 10 нуклео-тида. Стъпката или ходът на спиралата е 34Å, кое-то прави разстоянието между базите 3,4Å. Диаме-търът на спиралата е 20Å и той е постоянен по ця-лата дължина, поради комплементирането между различните по големина бази (вж. по-долу). Двойната верига на ДНК се означава като антипа-ралелна, което означава, че едната верига е насо-чена в посока 5’→3’, а другата - в посока 3’→5’. Само антипаралелни, комплементарни вериги мо-гат да образуват стабилна двойноспирална струк-тура. Двойната спирала не е напълно симетрична на оста си и погледната отвън образува особени структури, наречени голяма бразда и малка браз-да. Тези бразди са важни за свързване с белтъци, за репликация и за експресията на генетичната ин-формация. Двойната верига е дясно-въртяща. Това означава, че ако тя беше спирална стълба, и ние се изкачваме по нея, захаро-фосфатния скелет ще бъде от дясната ни страна.

Структура на РНК

Структурата на РНК е сходна с тази на ДНК, като обаче се наблюдават и редица важни различия. В РНК вместо 2’-дезоксирибоза участва рибоза, а азотната база тимин е заменена с урацил, който също може да комплементира с аденина (Фиг. 1.7). Освен това РНК винаги съществува ка-то единична верига, за разлика от ДНК. Въпреки това и в РНК е възможно да се из-вършва комплементарно свързване между участъци в една и съща верига, при което се формират двойноверижни структури.

Когато ДНК се изолира и кристализира при различни условия, тя образува раз-лични варианти на спиралата, известни като алтернативни ДНК структури. Формата ДНК, която беше описана и за която се счита, че съществува в клетката, се означава като В-ДНК или спирала на Крик-Уотсън. Всъщност това е формата ДНК с високо водно съдъжание, изследвана от Розалинд Франклинд, на която най-добре се вижда спиралната структура. Съществува и А-ДНК, при която структурата е по-плътно опако-вана. Други варианти са С, D и E, с различни параметри на спиралата. Особено различ-на е формата, наречена Z-ДНК, тъй като тя е ляво-въртяща и има особен, начупен ход на захаро-фосфатния скелет. Установени са участъци в някои хромозоми, в които ДНК има формата на Z-структура.

Комплементарно свързване на базите

Базите на двете полинуклеотидни вериги си взаимодействат една с друга. Разсто-янието между двата нуклеотида е такова, че двупръстенните пурини взаимодействат с еднопръстенните пиримидини. Така например тиминът взаимодейства винаги с аденин, а гуанинът – с цитозин. Между двойките бази се формират водородни връзки, които помагат за стабилизиране на структурата. Между А и Т се образуват две водородни връзки, а между G и C – три връзки. Така че свързването между G и C е по-здраво от свързването между А и Т. Начинът, по който се образуват връзки между нуклеотидите 3

в двете вериги на ДНК се нарича комплементарно свързване на базите и е от фунда-ментално значение за функционирането на ДНК (Фиг. 1.6). Други комбинации от нук-леотиди освен G-C или А-Т не могат да се образуват, защото или са много големи или много малки, за да се съберат в двойноверижната спирала, или не могат да се подредят правилно, за да се образуват водородните връзки. Тъй като С винаги трябва да се свър-зва с G и А с Т, секвенциите на двете вериги се означават като комплементарни, като по секвенцията на едната верига може да се предвиди секвенцията на другата верига. Това означава, че едната верига може да се използва, за да се възпроизведе другата. Това е ключовият механизъм за запазване на генетичната информация и за предаването й от една клетка на друга при клетъчното делене. Комплементарното свързване на базите е важно и за експресията на генетичната информация, и е основният начин, по който сек-венцията на ДНК се превръща в секвенция на иРНК и се транслира в белтък.

Двойната верига се стабилизира чрез водородните връзки. Като цяло водородните връзки могат да се разрушат чрез добавяне на някои химични вещества или чрез нагря-ване. Този процес се нарича денатурация и може да се демонстрира in vitro върху изо-лирана ДНК, като денатурацията се отчита по повишаване на оптичната плътност на разтвора на ДНК при 260 nm, явление, известно като хиперхромен ефект. В клетката двете вериги на спиралата могат да се разделят от ензими за копиране на ДНК или за експресия на генетичната информация. Характерно е, че области, които са богати на АТ двойки са по-лабилни и могат по-лесно да се разделят, което се наблюдава обикновено при свързване на различни регулаторни белтъци, което става по време на експресията.

Структура на РНК

Структурата на РНК е сходна с тази на ДНК, като обаче се наблюдават и редица важни различия. В РНК вместо 2’-дезоксирибоза участва рибоза, а азотната база тимин е заменена с урацил, който също може да комплементира с аденина (Фиг. 1.7). Освен това РНК винаги съществува ка-то единична верига, за разлика от ДНК. Въпреки това и в РНК е възможно да се из-вършва комплементарно свързване между участъци в една и съща верига, при което се формират двойноверижни структури.

Редактирано Март 17, 2007 от ROCK

[ROCK]

3 Гени

Структура на гените

Биологичната информация, необходима за възпроизвеждане на един организъм се съдържа в ДНК. Информацията се кодира в секвенцията от нуклеотиди по веригата и е организирана в дискретни единици, наречени гени, всеки един от които съдържа ин-формация за синтез на една полипептидна верига. От физична гледна точка генът е дискретен участък от ДНК с нуклеотидна секвенция, която кодира аминокиселинната секвенция в белтъка. Големината на гените варира изключително много – от по-малко от 100 - до няколко милиона базови двойки (bp). Във висшите организми гените се на-мират върху поредици от изключително дълги участъци ДНК, наречени хромозоми. В човешкия геном има около 30 000 гена, организирани върху 23 хромозоми. Гените са доста силно разпръснати върху генома и са разделени от участъци ДНК, които изглеж-да не съдържат полезна генетична информация, които се означават като междугенна ДНК. Тази ДНК е много дълга и при човека генната секвенция обхваща не повече от 30% от общата ДНК. Само едната верига на ДНК носи генетична информация, нарича се матрична верига и тя се използва за получаване на РНК с комплементарна секвен-ция, която пък ръководи белтъчната синтеза. Другата верига се нарича нематрична верига. Всъщност обаче всяка от двете вериги има възможност да играе ролята на мат-рична и различните гени се кодират от различни вериги. Съществуват и други термини за разграничаване на двете вериги – например кодираща/некодираща или смисло-ва/антисмислова (sense/antisense), като термините смислова и кодираща са синоними на матричната верига. По отношение на процеса репликация, едната верига се означава като водеща (leading strand), а другата като закъсняваща (lagging strand), като тези тер-мини определят различният начин, по който двете вериги се реплицират. Коя от двете вериги ще играе кодираща функция е вероятно определяно от дългият процес на ево-люция на генома.

Капацитетът на ДНК да кодира генетична информация е огромен. Както вече бе-ше споменато, разнообразието на една верига ДНК, състояща се от n нуклеотида е 4n. Дори и за късите секвенции ДНК разнообразието много голямо. На практика има извес-тни ограничения в секвенциите, които могат да носят полезна информация, но и тогава комбинациите от секвенции са много.

Генни семейства

Повечето гени са пръснати сравнително равномерно върху по хромозомите, макар че има и такива, които са организирани на групи или клъстери (clusters). Има две гру-пи клъстери – оперони и генни семейства.

Опероните са генни групи в бактериите. Те съдържат гени, които се регулират координирано и белтъчните продукти, които кодират са със свързани функции, много често представляващи ензимите на една метаболитна верига. Пример за такава група е лактозният оперон на E. coli. (lac-оперон), който кодира три ензима, необходими за ме-таболизиране на лактозата. Когато в клетката има лактоза като енергиен източник, то-гава трите ензима, кодирани от lac-оперона са налице едновременно за трите последо-вателни химични реакции за разграждане на лактозата. Групирането на гените в оперо-на позволява те да бъдат изключвани и включвани едновременно, което позволява на организма да използва ефективно своите ресурси (Фиг. 1.8).

Във висшите организми няма оперони и гените са групирани в генни семейства. За разлика от опероните, гените в мултигенните семейства са идентични или много сходни и не се регулират координирано. Групите гени в тези семейства отразяват нуж-дата от множество копия от един ген. Те са се образували чрез дубликации по време на еволюцията. Някои генни семейства съществуват като различни клъстери, разпръснати по различни хромозоми. Това вероятно е станало чрез пренареждане на ДНК през ево-люцията, което е предизвикало и разкъсване на клъстерите. Мултигенните семейства могат да са прости и сложни. В простите мултигенни семейства гените са еднакви. Пример за това е генът за 5S рибозомна РНК (рРНК). При човека има 2 000 такива гена, което отразява високата нуждата от този продукт. Сложните мултигенни семейства съдържат гени, които са много сходни, но не са идентични. Пример за това е семейст-вото глобинови гени, които кодират синтезата на различни белтъци (α, β, γ, ε и ζ глоби-ни), които се различават помежду си само с няколко аминокиселини (АК). Глобиновите белтъци могат да образуват комплекси с кофакторна молекула – хем, и тогава се получава един кръвен протеин, който служи за пренасяне на кислорода – хемоглобин.

Експресия на гените

Биологичната информация в ДНК се намира в секвенцията на нуклеотидите във веригата. Генната експресия е процес, при който информацията става достъпна за клет-ката. Използването на информацията се описва от т. нар. централна догма в молеку-лярната биология. Тя е изказана първоначално от Крик и гаси, че генетичната инфор-мация се прехвърля от нуклеинова киселина към нуклеинова киселина и от нуклеинова киселина към белтък (Фиг. 1.9). По време на експресията ДНК копира своята информа-ция в молекула РНК с комплементарна секвенция и този процес се нарича транскрип-ция. РНК след това ръководи синтезата на белтък, като последователността на АК в белтъка се определя от секвенцията на РНК. Този процес се нарича транслация. Ами-нокиселинната последователност на белтъка определя неговата пространствена струк-тура, която пък определя функцията му. Централната догма дефинира еднопосочно пренасяне на генетичната информация в посока ДНК → РНК → белтък и не може да се движи обратно. Малко по-късно е установено едно изключение при ретровирусите, съ-държащи ензима обратна транскриптаза (ревертаза), който може да копира верига ДНК върху РНК матрица. Функционирането на клетката, а едновременно с това и на целия организъм зависи от координираната активност на множество различни белтъци. Биологичната информация, намираща се в гените функционира като последователност от инструкции за синтезиране на белтъци в определено време и на определено място.

Промотори на гените

Експресията на генетичната информация, намираща се в гените е във висока сте-пен регулирана. Не всички гени, които се намират в клетъчната ДНК се експресират, а различните гени са активни само в определени клетъчни типове. Общата комбинация гени, които са активни, определя характеристиката на клетката и функционирането и в организма. Така например много от гените, които са активни в мускулната клетка са различни от тези, които се експресират в нервната клетка. Експресията на гените се ръ-ководи от една секвенция в ДНК, наречена промотор, намираща преди кодиращата секвенция. В промотора съществуват консервативни секвенции, които се разпознават и свързват с ензима РНК полимераза, и други, регулаторни белтъци, известни като тран-скрипционни фактори, които предизвикват синтезата на РНК транскрипт от гена. Ек-спресията на гена в клетката се определя от секвенцията на промотора и неговата спо-собност да се свързва с РНК полимеразата и транскрипционните фактори.

Интрони и екзони

Една доста изненадваща характеристика на еукариотните гени, е че кодиращата информация е обикновено разделена на серия ДНК секвенции, наречени екзони. Те са разделени от серия секвенции, които не носят полезна генетична информация и се оз-начават като интрони (Фиг. 1.10). Броят на интроните варира силно от нула до около 50 в някои гени. Дължината на екзоните и интроните също варира, като обикновено интроните са по-дълги и всъщност представляват по-голямата част на гена. Преди гене-тичната информация да се експресира в белтък, интроните трябва да се премахнат от

РНК чрез процес, който се нарича сплайсинг. Този процес превръща РНК в непрекъсната кодираща секвенция. Интроните са характерни за висшите организми и обикновено не се откриват в бактериите.

Псевдогени

Съществуват гени, които наподобяват други гени, но изследването на тяхната секвенция показва наличие на грешки, което ги прави безсмислени като генетична ин-формация. Те се наричат псевдогени и са произлезли от нормалните гени, натрупали много мутации по време на еволюцията. Те са станали причина за объркване на гене-тичната им информация, така че променените гени вече не са способни да ръководят синтезата на дадения белтък. По този начин псевдогените са еволюционни реликти. По време на еволюцията началните промени в базите, предизвикващи загуба на генетична информация са последвани от по-съществени промени, така че секвенцията на псевдо-гените в края на краищата съществено се различава от оригиналния ген. Пример за това са някои глобинови псевдогени, които се намират в глобиновите клъстери.

[ROCK]

4 Генетичен код

Генетичният код описва как секвенциите от нуклеотиди се превръщат в аминоки-селинна секвенция по време на белтъчната синтеза. Секвенцията на ДНК в гена е раз-делена на серия от единици, съставени от три бази. Всяка комбинация от три бази се нарича кодон и определя дадена аминокиселина (АК). Четирите бази в ДНК или в РНК могат да дадат максимална комбинация от 43 = 64 кодона, които определят 20 аминоки-селини в белтъка (Таблица 1). Тъй като броят на кодоните е по-голям, всички АК, с из-ключение на метионин и триптофан, се кодират от повече от един кодон. Тази особе-ност на генетичния код се означава като изроденост. Кодоните, които определят една и съща АК се наричат синонимни и са сравнително сходни. Например всички кодони ACU, ACC, ACA и ACG определят АК треонин. Разликите в кодоните са само в базата на трета позиция, която се означава люлееща позиция (wobbling). Изродеността на кода намалява ефекта от мутациите, така че промените в секвенцията на ДНК имат по-малък шанс да променят секвенцията на АК в белтъка и да променят неговата функция. От всичките 64 кодона 61 са за кодиране на АК. Останалите три, UAG, UGA и UAA не кодират АК, а служат като сигнали за спиране на белтъчната синтеза и са известни като терминиращи кодони. Кодонът за метионин, AUG, служи като сигнал за начало на транслацията и се нарича иницииращ кодон. Това означава, че всички белтъци започ-ват с метионин, макар, че понякога тази АК се премахва.

Таблица 1. Генетичен код

Рамки на четене

Иницииращият кодон не само определя старта на белтъчната синтеза, но дефини-ра и рамката на четене (reading frame) в секвенцията на РНК. В зависимост от това коя база е избрана за начало на кодона има три възможни комбинации от кодони, които могат да се прочетат от базовата секвенция. На практика при синтезата на белтъка само една от тези рамки има смислена информация за синтез на белтък; другите две рамки обикновено водят до стоп-кодони, което не позволява използването им за пряка синтеза на белтък (Фиг. 1.11).

Рамка на четене 1: 5’ AUG ACU AAG AGA UCC GG -3’

Met Thr Lys Arg Ser

Рамка на четене 2: 5’A UGA CUA AGA GAU CCG G -3’

Stop Leu Arg Asp Pro

Рамка на четене 3: 5’ AU GAC UAA GAG AUC CGG -3’

Asp Stop Glu Ile Arg

Всяка секвенция ДНК може да бъде четена в три отделни рамки, в зависимост от това от коя база започва кодона.

Групата последователни кодони, заобиколена от едната страна от стартовия ко-дон, а от другата с – терминиращия се нарича отворена рамка на четене (open reading frame – ORF). Тази характеристика се използва в проектите за секвениране на геномите (какъвто беше човешкия) за означаване на белтък-синтезиращите секвенции в ДНК.

Универсалност на кода

Първоначално се считаше, че генетичният код е универсален и че всички орга-низми интерпретират дадения кодон като една и съща аминокиселина. Въпреки, че като цяло това е така, все пак бяха установени някои редки различия в генетичния код. Така

например в митохондриите, в които има малък геном от ДНК, съдържащ около 20 гена, се открива отклонение в генетичния код. Промените са свързани главно със стоп и старт кодоните. Например UGA, който нормално е стоп-кодон тук кодира триптофан, докато AGA и AGG, които обикновено кодират триптофан са стоп кодони. Кодонът за изолейцин AUA, в митохондриите е кодон за метионин. Предполага се, че тези проме-ни могат да съществуват, защото митохондриите са затворени системи. Няколко други примера за необичайни кодони са установени в едноклетъчни организми. Така напри-мер в някои първаци UAA и UAG, които са терминиращи кодони, тук кодират глута-минова киселина.

4_____________.doc

[ROCK]

5 Транскрипция на гените

Транскрипция

обща характеристика

При този процес се синтезира РНК копие от секвенция ДНК като първо ниво на експресия на гените. РНК се синтезира от ензим, наричан РНК полимераза, като се използва ДНК като матрица. Двете вериги на спиралата на ДНК се наричат матрична и нематрична верига. РНК се синтезира като се използва матричната верига и получе-ната РНК е копие на нематричната верига (Фиг. 1.12). Секвенцията на гените се дава обикновено като секвенция на нематричната верига. Други имена, които се използват за номенклатура на веригите са кодираща верига или смислена верига (sense, +). Син-тезираната РНК се нарича транскрипт и по-късно може да се използва за транслация (синтез на белтък) или пък като транспортна (тРНК) или рибозомна (рРНК).

По време на транскрипцията РНК се синтезира чрез полимеризация на рибонук-леотид трифосфати (ATP, GTP, CTP, UTP). При това, както и при ДНК, 3’-ОН групата на един нуклеотид реагира с 5’-фосфата на друг нуклеотид, за да се образува фосфоди-естерна връзка. Редът, по който се добавят рибонуклеотидите към растящата верига РНК се определя от реда на базите в матрицата ДНК. Новите рибонуклеотиди се доба-вят към свободния 3’-край на растящата верига. Транскриптът се синтезира в посока 5’-3’ и тъй като веригите във временния дуплекс (РНК-ДНК) трябва да са антипаралелни, матричната верига ДНК се чете в обратна посока – 3’-5’.

Транскрипция при прокариотите

При прокариотите транскрипцията се извършва на три фази, известни като иници-ация, елонгация и терминация. РНК се синтезира от един единствен ензим РНК поли-мераза, който съдържа множество белтъчни субединици: две α, една β, една β’ и една σ

Транскрипцията на матричната верига ДНК дава РНК транскрипт със същата сек-венция, както нематричната верига на ДНК

(2αββ’σ). Тази форма се нарича холоензим. Сигма (σ) субединица-та може да се дисоци-ира от останалите су-бединици и тогава се получава форма, наре-чена кор-ензим. Тези две форми играят раз-лична роля в процеса транскрипция.

Инициация

Транскрипцията не може да започне на случайно място, а това става в началото на гена. Сигналите за на-чало на транскрипция се намират в една об-ласт, наречена промо-торна секвенция, на-мираща се непосредст-вено преди (upstream) транскрибираната сек-венция на гена. Про-моторът съдържа спе-цифични секвенции ДНК, които играят ро-ля за свързване с РНК полимеразата. При E. coli тези секвенции, които разпознават РНК полимеразата и са постоянни (консервативни) за всички промо-тори са -10 секвенцията (блок на Прибноу) и -35 секвенцията. Точната им секвенция в различните промотори може да варира в известни граници, но всички тези секвенции имат сходни общи характеристики, поради което се наричат консервативни (consensus). Сигма субединицата е отговорна за разпознаването и свързването с промо-тора, което вероятно става в -35 блока. При липса на σ ензимът пак може да се присъе-дини към промотора, но свързването е по-случайно. Когато ензимът се свърже с промо-тора, той първоначално образува затворен промоторен комплекс, в който промотор-ната ДНК остава интактна и двойноверижна. Ензимът покрива около 60 нуклеотида от промотора, включително -10 и -35 секвенциите. За да започне транскрипцията, двойна-та верига в областта -10 частично се разплита, тъй като този блок е изграден изключи-телно от А-Т двойки (ТАТААТ) и тогава се формира отворен промоторен комплекс. След това σ субединицата се отделя от отворения промоторен комплекс, в който остава кор-ензима. В същото време първите два рибонуклеотида се свързват с ДНК, между тях се формира първата фосфодиестерна връзка и транскрипцията започва

Транскрипция на матричната верига на ДНК дава РНК със секвенция, идентична на нематричната

Елонгация

По време на елонгацията РНК полимеразата се движи по молекулата ДНК като я разделя на две единични вериги и едновременно я развива с придвижването си. Ензи-мът добавя рибонуклеотиди към 3’-края на растящата верига РНК, като редът на нукле-отидите се определя от секвенцията на базите в матрицата ДНК. В повечето случаи в началото се транскрибира една лидерна секвенция с различна дължина, преди да за-почне транскрипция на кодиращата част на гена. По подобен начин в края на тран-скрипцията се синте-зира трейлърна сек-венция, преди да за-върши транскрипция-та. По време ма син-тезата на РНК само малка част от двойна-та верига на матрица-та е разплетена. Разп-летеният участък съ-държа част от ново-синтезираната верига РНК на разстояние около 12-17 бази, която е временно свързана в комплементарна двойноверижна структура с ДНК, означавана като хетеродуплекс. Развитата област трябва да не се увеличава много, тъй като развиването на един учас-тък ДНК, води до допълнително завиване на друг (суперспирализация) и това ще зат-рудни транскрипцията. За да се избегне този ефект РНК се освобождава от комплекса и ДНК отново става двойноверижна.

Терминация

Терминацията на транскрипцията също не става на случайни места, а след достигане на края на кодиращата секвенция на гена на участъци, извес-тни като палиндроми. Това са участъ-ци, които имат ос на симетрия, като от двете страни секвенциите са обърнати и повтарящи се. В едноверижните РНК, които се получават като копие на тези участъци, едната част на подобни секвенции може да се свърже в комп-лементарна структура с другата част и да образува двойна верига, известна като структура стъбло-бримка (Фиг. 1.15). Изглежда, че такива секвенции служат като сигнали за терминация. В някои случаи секвенцията стъбло-бримка е последвана от 5-10 аденино-ви (А) нуклеотиди в ДНК, който фор-мира слабо свързан А-U участък с но-восинтезираната РНК. Предполага се, че РНК полимеразата спира за момент веднага след структурата стъбло-бримка, което причинява разпадането на слабия участък А-U и това предизвиква отделянето на транс-крипта от матрицата. В други случаи тази последователност от поли-А липсва и тогава се използва различен механизъм, базиран на наличието на белтък, наречен Rho (ρ), който разкъсва хетеродуплекса между матрицата и РНК, когато РНК полимеразата спре при структурата стъбло-бримка. Терминацията на транскрипцията включва отделяне на транскрипта и на кор-ензима, който след това може да се свърже с нова сигма-частица и да започне нов цикъл на транскрипция.

Трябва да се отбележи, че терминаторната секвенция е част от края на структур-ния ген и по това се различава от промотора, който не е част от гена, а е само сигнална секвенция. Затова и разпознаването на промотора се базира на консервативни участъци, а на терминатора - на базата на вторична структура. Тъй като терминаторите са части от кодиращите секвенции на гените, там не може да има консервативни участъци.

Транскрипция при еукариотите

Транскрипцията при еукариотите е сходна с тази на прокариотите, но инициация-та е по-сложна. При нея терминацията не използва структурата стъбло-бримка и самият процес на транскрипция се извършва от три ензима (РНК полимераза I, II и III), всеки от които транскрибира определена група гени. Еукариотните РНК полимерази освен това функционират по малко по-различен начин.

РНК полимераза I

Този ензим транскрибира гени, които кодират синтезата на белтъци. Свързването на РНК полимераза II към промотора включва участието на няколко секвенции и до-пълнителни белтъци, наречени транскрипционни фактори. Промоторът обикновено (но не винаги) съдържа секвенция, наре-чена ТАТА блок, която функци-онира като място за свързване с ензима РНК полимераза II. Този участък притежава консерватив-ната секвенция 5’ ТА-ТА(А/Т)А(А/Т) 3’ и се намира на около 25 нуклеотида преди (upstream) старта на кодиращата секвенция. Неговата роля е да локализира РНК полимеразата в стартовия участък на гена в пра-вила позиция за започване на транскрипцията. Присъединява-нето на РНК полимеразата към промотора се извършва с помощ-та на серия транскрипционни фактори, специфични за РНК по-лимераза II. Те се означават като TFIIA, TFIIB, TFIIC и т.н. Те се свързват с ДНК около ТАТА бло-ка и образуват платформа за свързване на РНК полимераза II. Факторите се свързват в определен ред. Пръв се свързва TFIID, след това TFIIA, последвани от свързване на ен-зима и TFIIF, Е, H и J, което формира иницииращия комплекс за транскрипцията (Фиг. 1.16).

Гените, при които липсва ТАТА блок могат да имат алтернативни инициаторни елементи около транскрипционния стартов участък. При други гени може да липсва ТАТА и каквито и да са други елементи. Подобни гени се транскрибират с ниска често-та и инициация на транскрипцията може да започва на различни места. Тези гени често съдържат секвенции, богати на GC, намиращи се на около 100-200 нуклеотида преди транскрипционния старт.

Има няколко други промоторни елементи, които приличат на консесусните и вли-яят на транскрипцията. Тези секвенции действат като свързващи участъци за други транскрипционни фактори, които регулират транскрипцията като стимулират или реп-ресират инициацията. Пример за това е САТ блока (ССАААТ), който се намира преди ТАТА в някои гени. Много гени съдържат секвенции, наречени енхансери (enhancer), които силно стимулират транскрипцията. Те се намират извън промотора, в някои слу-чаи далеч от гена, който регулират и действат независимо от ориентацията си. Същест-вуват и няколко секвенции, известни като заглушители (silencers), които инхибират транскрипцията.

Терминацията на транскрипцията при РНК полимераза II става на участък към края на белтък-кодиращата секвенция с механизъм, който не е добре известен. Терми-наторните сигнали са трудни за разпознаване, тъй като 3-края на транскрипта се пре-махва много бързо след неговото синтезиране. Възможно е и да няма специални терми-наторни сигнали, а отделянето на някой от транскрипционните фактори на определен етап да дестабилизира комплекса, което да причинява отделянето на РНК полимеразата на по-късен етап.

Инициацията на транскрипцията при РНК полимераза I и III е сходна с РНК по-лимераза II и използва специфични промоторни секвенции, които действат като свърз-ващи участъци за РНК полимеразите и съответните транскрипционни фактори (TFI за РНК полимераза I и TFIII А-С за РНК полимераза III).

РНК полимераза ІI

Този ензим транскрибира гени, кодиращи трите рибозомни РНК (18S, 28S, и 5.8S). Промоторът, който се разпознава от РНК полимераза I има два важни елемента, които са необходими за ефективна транскрипция – един основен елемент, припокри-ващ се със старта и друг, намиращ се около 100 нд нагоре от транскрипционния стар-тов участък. Секвенциите свързват РНК полимеразата I и свързаните с нея транскрип-ционни фактори. Основната секвенция е най-важна за започване на транскрипцията, а по-далечната от старта секвенция участва в стимулиране скоростта на инициация на транскрипцията. Терминиращият сигнал се състои от 18 консенсусни секвенции и се намира на около 800 нд след края на гена.

РНК полимераза III

Този ензим транскрибира група гени, кодиращи транспортните РНК и 5S рибо-зомните РНК. Промоторните секвенции, които се разпознават от РНК полимераза III са необичайни, тъй като се намират в кодиращата секвенция на гена. Те са известни като вътрешни контролни области (internal control regions, ICR) и се намират на 100 бази навътре след старта на транскрипцията. Гените за 5S рРНК съдържат секвенции, извес-тни като С-блок, който действа като свързващ участък за транскрипционните фактори и РНК полимераза III. Има и друга А-секвенция, намираща се преди старта на транск-рипцията, която също е важна за инициацията. ICR при гените за тРНК са две висококонсервативни секвенции - А-блок и В-блок, които заедно действат като свързващ участък за транскрипционните фактори и РНК полимераза III. Терминацията на РНК полимераза III става при секвенции ДНК, които съдържат участъци от поли-А, появя-ващи се близо след края на гена.

[ROCK]

6 Транспортна РНК

Роля в транслацията

Клетките съдържат три вида РНК – транспортна, рибозомна и информационна, които се транскрибират от ДНК. Транспортната и рибозомната РНК формират част от апарата на белтъчната синтеза, а иРНК участва като матрица за синтеза на белтъци по време на транслацията.

Транспортните РНК (тРНК) са малки молекули, които действат като адаптери по време на белтъчната синтеза. Те са връзката между нуклеотидната секвенция на ин-формационната РНК (иРНК) и аминокиселинната секвенция на белтъка. Клетките съ-държат определен брой тРНК, всяка от които може да се свързва само с определена аминокиселина (АК). Всяка тРНК различава един кодон в иРНК, което ú позволява да поставя АК на правилна позиция в растящата полипептидна верига, както е определено от секвенцията на иРНК.

Структура

Транспортните РНК се състоят от 74-95 нуклеотида. В една тРНК има комплемен-тарни области, поради което се формира вторична структура, известна като детелинов лист, специфична за тРНК (Фиг. 1.17). Детелиновият лист се състои от няколко струк-тури стъбло-бримка, известни като рамене. Те са:

Акцепторно рамо, което се фор-мира с комплементарно свързване меж-ду 3’ и 5’-краищата на веригата тРНК. Секвенцията ССА, която се намира на 3’-края на веригата на всички тРНК е несдвоена с други нуклеотиди и нуклео-тида А е мястото на свързване на ами-нокиселината.

D-рамо (или DHU) е структура стъбло-бримка, съдържащо дихидроу-рацил (D), който е необичаен нуклеотид с модифицирана азотна база.

Антикодоново рамо, отговорно за разпознаването и свързването на кодона в иРНК. Съдържа антикодон, компле-ментарен на кодона.

Допълнително или вариабилно рамо се наблюдава само при някои тРНК. То може да е малко, съдържащо само 2-3 нуклеотида (клас I тРНК) или по-голямо, съдържащо 13-21 нуклеотида (клас II тРНК).

ТψС рамо, което съдържа секвенцията ТψС, където с ψ (пси) се означава необи-чайният, модифициран нуклеотид псевдоурацил.

Сравняването на различните тРНК показва, че част от нуклеотидната секвенция е консервативна. На определени позиции да-дени нуклеотиди са едни и същи във всички тРНК. На други места може винаги да се среща пурин или пиримидин, което се озна-чава като полу-инвариантност. В останали-те места нуклеотидите не са консервативни и варират.

Детелиновият лист е двуизмерното описание на тРНК. По-точно представяне на тРНК се получава от триизмерната структура (3D), получена на базата на рент-гено-структурен анализ .Нукле-отидите, които са свързани заедно в двуиз-мерна структура са свързани освен това с особени, некомплементарни водородни връзки между нуклеотиди, които са разда-лечени и са на различни рамене и те образу-ват 3D структурата. Тези връзки се означа-ват като третични, тъй като образуват тре-тичната структура на тРНК. Много от нуклеотидите, които са свързани са консерватив-ни или полу-инвариантни. В 3D структурата акцепторното рамо и антикодоновото рамо са на про-тивоположните краища на моле-кулата в съответствие с противо-положните им функции в транс-лацията.

Синтеза и процесинг

Транспортната РНК се син-тезира чрез транскрипция на гени за тРНК от ензима РНК полиме-раза III (вж. раздел 1.4). Гените съществуват като множество ко-пия, особено в еукариотните клетки, отразявайки голямата нужда на клетките от тРНК. Тя се синтезира като предшественик на молекулата, наречен пре-тРНК, който след това се обработва (процесира), за да даде зрялата тРНК . Няколко тРНК гена могат да се транскрибират заедно като една единична пре-тРНК, която след това се проце-сира от рибонуклеази, които ре-жат на 3’ и на 5’-края на всяка секвенция за тРНК. При прока-риотите това става по определен ред от рибонуклеазите РНКаза D и РНКаза Р, които се откриват в прокариоти и еукариоти. Необичайното на тези ензи-ми, е че в тях се открива РНК компонент с каталитична активност, известна като рибо-зим. Еукариотните тРНК се различават от техните прокариотни аналози по това, че съ-държат къса секвенция, интрон, който се отделя по време на процесинга по механизъм, известен като сплайсинг. На 3’-края на всяка тРНК се намира секвенцията CCA, за ко-ято се свързва аминокиселината (акцепторен край). При еукариотите в тРНК гените няма секвенция, която да е комплементарна на ССА, поради което тя се добавя по-късно от ензима тРНК нуклеотидил трансфераза. При прокариотните в гените за тРНК има съответната секвенция, но ССА често се откъсва от РНКазаD, поради което после се добавя от нуклеотидил трансферазата.

Модификация на нуклеотидите

Транспортната РНК има необичайни нуклеотиди, получени след процеса на тран-скрипция чрез химични модификации. Най-типичните модификации са:

Метилиране на рибозата в нуклеотида. Например гуанозина се превръща в 7-метилгуанозин.

Преподреждане на базите. Това включва размяна на позицията на атоми в пури-новия или пиримидиновия пръстен. Пример за това е конверсията на уридина до псев-доуридин.

Насищане на двойни връзки. Като пример е превръщането на уридина до ди-хидроуридин.

Деаминиране. Това означава премахване на амино група от базите. Например при деаминираме на гуанозина се получава инозин.

Замяна със серни атоми. Например замяната на кислороден атом със сяра в мо-лекулата на уридина дава 4-тиоуридин.

Добавяне на по-големи групи. Пример за това е конверсията на гуанозина до ку-езин.

Досега са описани около 50 типа подобни модификации, което става от различни модифициращи ензими. Причината за повечето модификации е не напълно изяснена, но в някои случаи е проучената тяхната роля в състава на антикодоновата бримка.

[ROCK]

7 Рибозомна РНК

Рибозоми

Рибозомите са макромоле-кулни структури, изградени основ-но от белтъци и рибозомна РНК (рРНК), свързани в надмолекулен комплекс. Рибозомите се намират в клетъчната цитоплазма. Клетъчни-те нужди за синтез на белтък изис-кват голям брой рибозоми. В една типична бактериална клетка има около 20 000 рибозоми, които представляват около 80% от цялата РНК в клетката и около 10% от клетъчните белтъци. Тъй като ри-бозомите са много големи (от мо-лекулна гледна точка) е трудно да се получат данни за тяхната моле-кулна маса. Вместо това рибозомите се измерват по тяхната константа S, известна като седиментационна константа (константа на Сведберг), която отразява движението на подобни комплекси във вискозни среди (разтвор на захароза или на цезиев хлорид), което става при центрофугиране. Стойността S се определя от големината, формата и макромолекулната структура на рибозомата.

Всяка рибозома се състои от две части, наречени голяма и малка субединици . В прокариоти като E. coli рибозомата е 70S и е съставена от две субединици – 50S и 30S (както се вижда S стойностите не се събират; не са адитивни). Голямата субединица (50S) съдържа две рРНК (23S и 5S) в комплекс с 31 рибозомни белтъка. 30S субединицата съдържа една единствена рРНК (16S) и 21 белтъка. Еукариотите рибозо-мите са 80S и се състоят от 60S и 40S субединици. Голямата 60S субединица съдържа три рРНК – 28S, 5.8S и 5S и около 40 белтъка; 40S субединицата съдържа една единст-вена рРНК (18S) и около 33 белтъка.

В рибозомата рРНК придобива специфична триизмерна структура, която се ста-билизира както от комплементарни връзки в бримковидни структури, така и между от-делните молекули рРНК. Смята се, че рРНК образуват една мрежа, в която са разполо-жени рибозомните белтъци, даващи основните функционални отнасяния на рибозомата. В рибозомата има и РНК молекули с каталитична активност (рибозими), които допри-насят за каталитичната активност на рибозомата, особено при образуване на пептидна-та връзка.

Транскрипция и процесинг на рРНК гените при прокариотите

Клетките съдържат голям брой рибозоми, които трябва да се удвояват, когато клетката се дели. В резултат на това клетките имат огромна нужда от синтеза на рРНК, което става чрез транскрибиране на гените за рРНК от РНК полимеразата. За да се осигури точен брой на произведените рРНК, те се продуцират от единствен ген, представен в много копия в генома. В прокариоти като E. coli има седем рРНК гени, разпръснати по целия геном. Всеки ген съдържа по едно копие от 16S, 23S и 5S секвенции рРНК, които са консервативно подредени. В допълнение, във всеки ген има между един и четири гена за тРНК. Гена се транскрибира и дава една единствена пре-рРНК (30S), която се процесира, за да даде отделните рРНК и тРНК . Процесингът се състои от серия добре дефинирани стъпки. След транскрипцията транскриптът се нагъва и обра-зува множество бримковидни структури, дължащи се на самокомплементарни участъци (структури стъбло-бримка). След това към нагънатата РНК се свързват белтъци. На то-зи етап някои от нуклеотидите се модифицират чрез метилиране. Най-накрая предшес-твеникът се реже на определени места от рибонуклеаза (РНКаза III), за да даде отдел-ните рРНК (16S, 23S и 5S). По-нататъшното рязане на 3’ и 5’ краищата от рибонуклеа-зи, наречени М5, М16 и М23, дава зрелите рРНК.

Транскрипция и процесинг на рРНК гени в еукариоти

При еукариотите сек-венциите на 18S, 28S и 5.8S рРНК се намират на единичен ген, който съществува в мно-го копия, разделени едно от друго от нетранскрибируеми области При чо-века има около 200 гена, ор-ганизирани в серии от пет клъстера от около 40 гена на различни хромозоми. Гените се транскрибират от РНК по-лимераза I в клетъчното ядро в област, известна като ядър-це. При човека се синтезира еднинична пре-РНК (45S), която се процесира, за да даде 18S, 28S и 5.8S рРНК 5S рРНК се транскри-бира отделно от РНК поли-мераза III от един нескачен ген като къса секвенция от 121 нуклеотида, която не пре-търпява процесинг. Еукари-отната пре-рРНК се процеси-ра по подобен начин на прокариотната. След транскрипцията и тя се нагъва и свързва с белтъци. Някои от нуклеотидите се модифицират чрез метилиране на рибозата. Тази реакция се катализира от молекула, съставена от белтък и РНК, наречена малка ядрена РНК (snRNA), формирайки малки ядрени рибонуклеопротеидни частици (snRNP, snurps). Зрелите 18S, 28S и 5.8S рРНК след това се формират чрез серия стъпки, в които пре-рРНК се реже от рибонуклеази. Първоначалното рязане става в области известни като външни транскрибирани спейсери (external transcribed spacers, ETSs). Следва рязане при вътрешни транскрибирани спейсъри (internal transcribed spacers, ITSs), при което се получават 20S и 32S предшественици на рРНК. По-нататъшното рязане дава зрели 18S, 28S и 5.8S рРНК. В последната стъпка на процесинга става комплемен-тарно свързване на 5.8S рРНК с 28S рРНК.

[ROCK]

8 Информационна РНК

Синтез и процесинг

При еукариотите информационната РНК (иРНК) се синтезира при транскрипцията на гени, кодиращи синтезата на белтъци от ензима РНК полимераза II. Тя служи за матрица за синтез на белтък при транслацията. Кодиращата информация на такива гени е фрагментирана и е организирана като поредица от екзони, разделени от некодиращи интрони. Информационната РНК се синтезира като предшественик, известен като пре-иРНК, която представлява копие и на екзоните и на интроните. Преди да послужи като матрица за синтез на белтъчната синтеза, пре-иРНК преминава през серия процеси на зреене (processing), за да се получи зрялата иРНК. Некодиращите секвенции на интро-ните се отделят с процес, известен като сплайсинг (splicing), който прави непрекъснати кодиращите секвенции и осигурява функционална иРНК за процеса транслация. В до-пълнение 5’-края се модифицира чрез добавяне на един модифициран нуклеотид, про-цес, известен като кепиране (caping). От своя страна 3’-края се модифицира чрез доба-вяне на около 250 аденинови нуклеотида. Процесът е известен като полиаденилиране. Молекулите РНК, синтезирани от ензима РНК полимераза II съществуват като попула-ция от молекули с различна дължина (в зависимост от различната дължина на гените) и на различни етапи на зреене и като цяло се означават като хетерогенна ядрена РНК или хяРНК (hnRNA).

В прокариотните иРНК не се процесира и транслацията започва на 5’ края дори още преди молекулата да е синтезирана изцяло. Нормално прокариотните гени не съ-държат интрони и затова сплайсинг не е необходим.

Сплайсинг

Този процес става в ядрото и представлява премахване на некодиращите секвен-ции на интроните от пре-иРНК, при което се получава зряла иРНК, в която кодиращите секвенции (екзоните) са непрекъснати. Зрелите иРНК след това се транспортират в ци-топлазмата, където действат като матрици за белтъчната синтеза.

Сплайсингът за-виси от наличието на определени секвенции в пре-иРНК. При почти всички гени първите два нуклеотида на 5’-края на интрона са GT, а последните два на 3’-края са винаги AG. Те са част от по-големи сигнални секвенции, които се намират на двата края на интрона. Цялата сигнална сек-венция на 5’-края е 5’AGGTAAGT 3’, a 3’-секвенцията е 5’YYYYYYNCAG 3’ (Y e пиримидин, а N – който и да е нуклео-тид). В допълнение при интроните на гръбначните се открива една допълнителна секвенция, 10-40 бази на-горе от 3’-сигналната секвенция - 5’ CURAY 3’ (R е пурин). Тази секвенция се означава като секвенция на точката на разклоняване (branch point sequence). Сплайсингът се извършва на два етапа . При първата стъпка 2’ОН-групата на аденина в разк-лонението атакува фосфодиестерната връзка между двойката бази GT на 5’-края (5’-сплайсингов сайт). Връзката се прекъсва, като освобождава 5’-края на интрона и го присъединява към точката на разклонение. Така интронът образува една затворена структура, наричана ласо (lariat). При втората стъпка 3’-краят на интрона се изрязва след G на секвенцията AG на 3’-края (3’-сплайсингов сайт), интронът се освобождава и двата екзона се свързват заедно.

Сплайсингът се катализи-ра от група молекули, означа-вана като малки ядрени рибо-нуклеопротеини (snRNPs, snurps). Те са съставени от мал-ки РНК молекули, богати на урацил, наречени U-РНК или малки ядрени РНК (snRNAs), които съществуват свързани с белтъци. Съществуват много различни snРНК, но най-мнобройни са U1, U2, U4, U5 и U6, които катализират реакции-те на сплайсинг. Всеки снурп съдържа една U-РНК, с изклю-чение на тези, които съдържат комплементарно свързани U4 и U6. РНК компонентът на снур-повете действа като се свързва комплементарно с връзката ин-трон-екзон (сигналната секвен-ция). U1 snРНК се свързва с 5’-сплайсинговия сайт, докато U2 snРНК се свързва със секвенция в точката на разклоняване. Ос-таналите РНК, U5 и U4/U6 след това формират комплекс с U1 и U2, който образува бримката на интрона (ласо) и свързва двата екзона. Комбинацията от пре-иРНК и снурповете дава структура, наречена сплайсозома, която е отговорна за правилното нагъване на пре-иРНК за сплайсинга . Сплайсозомата катализира също и реакциите на рязане и свързване, които изрязват интроните и свързват екзоните. След завършване на сплайсинга, сплайсозомата се отделя. Нейното функциониране не е напълно изяснено и основните елементи, отговорни за ензимните реакции не са идентифицирани все още.

Макар, че повечето интрони се изрязват със сплайсозома, има и някои особени случаи, когато се използват други механизми. Интроните на рибозомните гени на някои камшичести едноклетъчни образуват специфична триизмерна структура, която действа като ензим за изрязване на РНК, известен като рибозим и той действа за собственото си изрязване. Интрони има и в тРНК и те се изрязват под действието на рибонуклеази по подобен начин, както това става при рРНК.

Кепиране

Еукариотните иРНК се модифицират на своя 5’-край с един процес, известен като кепиране (capping), който включва добавяне на един модифициран нуклеотид, 7-метилгуанозин. Той се добавя с ензима 7-метилгуанозин трансфераза, който свързва GTP с необичайната 5’-5’ фосфодиестерна връзка. След това един ензим, метилтранс-фераза добавя метилова група при азота на седмо място в гуаниновия пръстен, както и към 2’-ОН групите на следващите два нуклеотида. Кепирането предотвратява разграж-дането на 5’-края на иРНК от екзонуклеазите на цитоплазмата, а също е сигнал за рибо-зомата за разпознаване на началото на транслацията.

Полиаденилиране

Повечето еукариотни пре-иРНК са модифицирани на своя 3’-край с добавяне на секвенция от 250 нуклеотида, известна като поли-А опашка. Тази модификация се на-рича полиаденилиране и изисква наличието на сигнална секвенция в пре-иРНК. Тя се нарича сигнална секвенция за полиаденилиране, 5’AAUAAA 3’, и се намира близо до 3’-края на пре-иРНК. В следващите 11-20 бази се намира секвенция YA (Y – пири-мидин), а по-нататък се намира друга секвенция, богата на GC нуклеотиди. Няколко специфични белтъка разпознават и се свързват с тези сигнални секвенции и образуват комплекс, който реже иРНК на няколко нуклеотида след секвенцията 5’AAUAAA 3’. След това ензимът поли-А полимераза добавя аденинови нуклеотиди към 3’-края. Роля-та на поли-А опашката не е добре известна, но може да предпазва 3’-края на кодираща-та секвенция от разграждане от цитоплазмените рибонуклеази. Въпреки това са извест-ни случаи, като особено типични са иРНК за хистоните, където няма поли-А опашка.

Стабилност на иРНК

За разлика от рРНК и тРНК, които са стабилни в клетката, иРНК е сравнително кратко живееща. Това е така, защото нуждите от белтък в клетката се регулират основ-но чрез промяна на нивото на транскрипция на гените. Тъй като иРНК са кратко-живеещи, промените в скоростта на транскрипция се отразяват на количеството иРНК, която е достъпна за белтъчна синтеза. В бактериите времето на полуразпад на иРНК е само няколко минути. При еукариотните организми иРНК са стабилни и времето им на полуразпад е около 6 часа, макар че има и иРНК, които са много по-дълго живеещи. Такива са например иРНК, транскрибирани от глобиновите гени. Тази стабилност обикновено се осъществява от свързването на иРНК с белтъци, даващи РНП комплекси.

Алтернативен процесинг на иРНК

Има случаи, при които начина, по който се процесират пре-иРНК варира и при това се получават различни иРНК от една и съща секвенция, а респективно и различни белтъци. Това се осъществява чрез алтернативен сплайсинг на пре-иРНК, при което в различните клетки се променя начина на използване на различните места на сплайсинг. При това дадени екзони могат да се изрязват или да остават в секвенцията на иРНК по време на сплайсинга. Освен това наличието на сигнали за алтернативно полиаденилиране може да даде иРНК с различен 3’-край . Нап-ример използването на необичайни версии от сигнали за алтернативен сплайсинг, намиращи се преди края на последния екзон (upstream), може да доведе до изключване на екзони, които се намират след тези сигнали (downstream), което дава скъсен белтък.

Една и съща пре-иРНК може да бъде процесирана алтернативно в една и съща клетка, в различни клетки и в клетки от един и същ клетъчен тип, но на различни нива на нейното развитие. Белтъците, които се синтезират в съответствие с алтернативния процесинг от пре-иРНК са сходни един с друг, но могат и да имат различни функции и характеристики. Например алтернативния процесинг на имуноглобулиновата пре-иРНК води до синтез на белтъци, които могат да имат хидрофобни аминокиселини или да ня-мат такива. Това води до образуването на имуноглобулинови белтъци, които или ще се свързват с мембраната или ще се секретират.

Пре-иРНК могат да претърпят алтернативен процесинг също и с едно явление, наречено редактиране на РНК (RNA editing). При този процес секвенцията на пре-иРНК се модифицира чрез инсерция, делеция или заместване на бази. Редактирането на РНК е открито за първи път при някои паразитни първаци, при които се установява, че транскриптът на някои митохондриални гени е силно променен чрез вмъкване на ура-цилови нуклеотиди. Примери за редактиране на РНК са намерени и в гръбначни, макар че установените модификации тук не са толкова интензивни. При хората пре-иРНК, транскрибирана от гена за апопротеин В се модифицира чрез замяна на С с U, което дава стоп кодон. Това води до синтеза на по-къса форма на белтъка. В клетките на чер-ния дроб, където не става редактиране, се образува белтък с пълна дължина.

Редактирано Март 17, 2007 от ROCK

[ROCK]

9 Транслация

Роля на транспортната РНК

Транслацията е процес, чрез който клетките синтезират белтък. По време на тран-слацията, информацията, кодирана от иРНК се използва, за да определи секвенцията на АК в белтъка. Транспортната РНК играе ключова роля в този процес, чрез осигуряване и транспортиране на АК до рибозомата в ред, който е определен от иРНК. Това гаран-тира, че АК ще се свържат в правилна последователност . Клетките съдър-жат от 31 до 40 отделни тРНК, всяка от които се свързва с една от 20-те АК. Съответно може да има повече от една тРНК за да-дена АК. Транспортни РНК, които свързват една АК се оз-начават като изоакцепторни. Преди да започне белтъчната синтеза АК се свързват кова-лентно с тРНК, които след това разпознават кодона в иРНК, отговарящ на дадена АК. Свър-зването на АК към тРНК се на-рича аминоацилиране или за-реждане. АК се свързва кова-лентно с края на акцепторното рамо на тРНК, което винаги завършва със секвенцията 5’CCA 3’. При това свързване се формира връзка между 3’-ОН групата на крайния аденин (А) на акцепторното рамо и карбоксилната група на аминокиселината. Зареждането се катализира от един ензим, наречен аминоацил-тРНК синтетаза с реакция, която изисква хидролиза на АТФ (АТР). За всяка АК има отделен ензим и този ензим може да зареди всички изоакцепторни тРНК, отговарящи за тази АК. Ензимът аминоацил-тРНК синтетаза разпознава едновременно аминокиселината и съответната тРНК. АК се разпознава основно по страничната си верига. Не е много ясно как се разпознава тРНК, но се предполага, че причина за това са различни нуклеотиди, които са специфични за всяка тРНК.

Разпознаване на кодона

Когато вярната АК е свързана с тРНК, последната разпознава кодона за тази АК върху иРНК, и това позволява тази АК да се постави на правилна позиция, определяна от секвенцията на иРНК. Това гарантира, че аминокиселинната секвенция, кодирана от иРНК се транслира правилно. Този процес изисква разпознаването на кодона от анти-кодоновата бримка на тРНК, и по-специално от три нуклеотида в нея, известни като антикодон, който се свързва с кодона на базата на комплементарното съответствие. Четирите бази, които изграждат РНК могат да дадат общо 64 комбинации от кодони (триплети). Три от тези кодони са стоп сигнали за спиране на белтъчната синтеза, а ос-таналите 61 са за 20те АК, от които са изградени белтъците. Съответно повечето АК са представени с повече от един кодон, особеност, която е известна като изроденост на генетичния код (degeneracy of the genetic code). Тази особеност означава, че отделните тРНК могат да различават повече от един кодон за техните АК. Това може да стане, защото антикодонът е способен да се свърже с алтернативни бази, които се намират на трето място в кодона, нещо, което е известно като изроденост на третата база или люлеене (wobble). Свързването между кодона и анткодона може да толерира вариации в третата база, защото антикодоновата бримка не е линейна и когато антикодонът се свързва с кодона в иРНК, не се формира идеална двойноверижна молекула тРНК (анти-кодон) иРНК (кодон). Това позволява формирането на няколко нестандартни компле-ментарни двойки. Така например G може да се свържа с U, така както с С в люлеещата позиция, а инозина (деаминираната форма на гуанина, който понякога се намира в лю-леещата позиция на антикодоновата бримка може да се свърже с С, но също така и с А и U. Люлеенето позволява една и съща тРНК да декодира повече от един член на ко-донното семейство, което силно намалява необходимия брой тРНК в клетката. Това не означава, че се нарушават правилата на генетичния код и даден белтък винаги се синте-зира стриктно в съответствие с нуклеотидната секвенция на иРНК. Едно важно следст-вие от това, че така се намалява ефектът от мутациите.

Транслация – обща характеристика

Транслацията става по сходни механизми при бактерии и еукариоти и за удобство на обяснението на механизмите се дели на три етапа – инициация, елонгация и тер-минация. Инициацията включва свързване на рибозомата към иРНК. Елонгацията е повтарящо се добавяне на АК, а терминацията представлява отделяне на новосинтези-раната полипептидна верига. Една група допълнителни белтъци (accessory proteins) по-магат на процеса транслация в трите му основни процеса. Транслацията изисква нали-чие на енергия, която се получава при хидролизата на GTP или АТР (ГТФ и АТФ). GTP се използва за движение на различните части на белтък-синтезиращия апарат (тРНК, иРНК и др.), както и за свързване на допълнителните белтъчни фактори. АТР се изпол-зва за зареждане на тРНК и за премахване на двойноверижни структури в иРНК. 90% от синтезирания АТР се използва от бактериите за белтъчна синтеза.

Инициация

Когато не са активно използвани в транслацията, рибозомите съществуват като отделни големи и малки субе-диници. Първата стъпка на транслацията представлява свързване на малката субеди-ница към иРНК . Транслацията започва обик-новено при кодона АUG (бак-териите понякога използват GUG и UUG), който кодира АК метионин и е известен кат иницииращ кодон. Малката субединица на рибозомата (30S) се свързва в определен участък преди AUG (upstream). При прокариотите това се означава като секвен-ция Шайн-Далгарно (Shine-Dalgarno, 5’AGGAGGU 3’), която се открива близо до старта на иРНК. Веднъж свързана, 30S мигрира в по-сока 3’ по иРНК, докато не намери AUG, което е обикно-вено на 10 нуклеотида по-надолу (downstream). При еу-кариотите малката рибозомна субединица разпознава пър-воначално кепирания 5’-край на иРНК. След това тя се движи по иРНК, докато не разпознае първия AUG кодон, макар че понякога се разпоз-нават като първи и други AUG кодони. Към AUG кодона, локализиран в малката субе-диница се свързва тРНК, заредена с метионин (тРНКmet). При бактериите метионинът е модифициран чрез свързване на една формилна група (-СНО) към водородния атом на аминогрупата (тРНКfmet). Това блокира аминогрупата за формиране на пептидна връзка и гарантира, че пептидна връзка ще се получи само в посока към карбоксилния край. Комбинацията от тРНКfmet, иРНК и малката субединица на рибозомата се нарича ини-цииращ комплекс. За разпознаване на AUG се използват две тРНК, които присъеди-няват метионин. Едната се използва за инициация (тРНКifmet), а другата, за разпознаване на вътрешните AUG кодони. Само инициаторната тРНК е способна да се свърже в ини-циаторния комплекс.

За инициацията са необходими определен брой допълнителни белтъци, известни като иницииращи фактори (IF). Бактериите имат три, известни като IF1, IF2 и IF3. Инициа-цията започва чрез свързване на IF1 и IF3 към 30S. Това гарантира, че голямата субединица няма да се свърже, преди да се присъединила иРНК. В следващата стъпка факто-рът IF2, зареден с GTP се свързва с малката субединица. Неговата цел е да подпомогне свързването на инициаторната тРНК. След това малката субединица се свързва с иРНК и локализира иницииращия AUG кодон. Към комплекса се свързва инициаторната тРНК, заредена с метионин и се отделя IF3. Това представлява краят на инициацията. Елонгацията започва със свързване на голямата субединица на рибозомата към иници-иращия комплекс, формирайки цялостната рибозома, при което се отделя IF1 и IF2 и става хидролиза на GTP.

Инициацията при еукариотите е сходна с бактериалната, с тази разлика, че ини-цииращия кодон тук е главно AUG, а метионинът не е формилиран. Тук участват зна-чително повече фактори (поне 9), като някои от тях са хомоложни с бактериалните. Има два фактора (eIF2 I eIF 3), чиято функция е сходна с техните аналози при бактери-ите (IF2 и IF3). Няколко от еукариотните фактори са отговорни за премахване на вто-рични структури по иРНК, преди тя да бъде транслирана. Енергия за това се взема от хидролизата на ATP. Един специфичен еукариотен фактор е eIF-4B, който участва в разпознаването на кепирания 5’ край на еукариотната иРНК.

Елонгация

Веднага след формирането на иницииращия комплекс, към него се свързва голямата субединица на рибозомата. Цялостната рибозома съдържа два свързващи участъка (сайта) за тРНК молекули . Първият участък се означава като Р или пептидилен сайт и е зает от тРНКifmet, свързана с кодона AUG. Вторият участък е А или аминоацилен сайт и е разположен върху втория кодон. Елонгацията започва когато една заредена тРНК навлезе в този участък и се свърже с втория кодон. В този момент в рибозомата има две заредени тРНК, при което двете им АК са в близко съседство и между тях мо-же да се образува пептидна връзка. Реакцията за образуване на пеп-тидната връзка се осъществява от голямата рибозомна РНК на голя-мата рибозома, която в случая иг-рае ролята на рибозим.

За елонгацията са необходи-ми множество допълнителни бел-тъци, наречени елонгационни фактори (EF). При еукариотите има два фактора, EF-Tu и EF-Ts, които участват в навлизането на тРНК в А-участъка. ЕF-Tu се свър-зва с тРНК, като предварително е 25 образувал комплекс с GTP. След навлизането в А участъка GTP се хидролизира и от рибозомата излиза EF-Tu, свързан с гуанозин дифосфат (GDP). Преди да се свърже с друга АК, EF-Tu се регенерира с помощта на EF-Ts. Първоначално EF-Ts измества GDP, а след това нова молекула GTP се свързва с EF-Tu, измествайки EF-Ts . При еукариотите има един комплексен белтък, eEF-1, който внася тРНК в А участъка. И тук реакцията е свързана с хидролиза на GTP. Не е ясно как се регенерира eEF-1, но може да се предполага, че има елементи като EF-Tu и EF-Ts.

След образуването на пептидната връзка се наблюдава един процес, на-речен транслокация, което представ-лява придвижване на иРНК на следващия кодон. Формираният ди-пептид (аа-аа) се придвижва в Р учас-тъка, измествайки вече празната тРНК, която се намира там. При това А учас-тъкът остава свободен и в него може да навлезе нова тРНК, при което елон-гационният цикъл се повтаря. При бактериите транслокацията се подпо-мага от белтък, наречен EF-G или транслоказа, който се свързва в рибо-зомата, свързан с GTP. И тук се из-вършва хидролиза на GTP, при което се отделя енергия за транслокацията. Свързването на EF-Tu и на EF-G е ал-тернативно и взаимно-изключващо се. Това гарантира, че транслокацията ще се извърши преди да започне нов ци-къл на елонгация. Еукариотният екви-валент на EF-G е eEF2, който също изисква GTP и функционира по подо-бен начин. Елонгацията може да се извършва и от няколко рибозоми едновременно на една иРНК, при кое-то се формира полирибозомен комп-лекс.

Терминация

Транслацията завършва, когато в А участъка попадне терминационен кодон (Фиг. 1.30). Не съществуват тРНК, които да се свързват с термина-ционния кодон. Вместо това в А учас-тъка навлизат допълнителни белтъци, известни като терминиращи фактори (release factors), които предизвикват отделянето на завършения белтък. В E. coli този процес се изпълнява от два фактора – RF-1 и RF-2. RF-1 разпознава терминиращите кодони UAA и UAG, докато RF-2 разпознава UAA и UGA. Трети терминиращ фактор RF-3 играе допълнителна роля в процеса. Тези факто-ри предизвикват прехвърлянето на последната АК на формирания белтък върху моле-кула вода, вместо към следващата аминоацил тРНК.

При еукариотите един единствен белтък eRF участва в терминацията и той също изисква свързване с GTP за свързване с рибозомата. След това той се хидролизира и eRF се отделя от рибозомата. Следва отделяне на синтезирания белтък, иРНК напуска рибозомата, която се дисоциира. След това субединиците се присъединяват към пула от рибозомни субединици, които участват в белтъчната синтеза.

Посттранслационни модификации

След транслацията ново-синтезираните белтъци могат да се подложат на пореди-ца различни модификации, преди да станат функционални белтъци. Тези промени са основно ковалентни свързвания на различни функционални групи и рязане на полипеп-тидната верига. Открити са освен това множество модификации на страничните вериги на АК, както и промяна в карбоксилния © и аминния (N) краища. Модификациите могат да са включване на малки групи, като метилиране, фосфорилиране, ацилиране и хидроксилиране, както и включване на по-големи молекулни структури като липиди или олигозахариди (гликозилиране). Някои модификации, като фосфорилирането регу-лират ензимната активност. Отрязването на полипептидната верига е много типична модификация и може да представлява рязане на терминална АК, откъсване на вътреш-ни пептиди, откъсване на аминотерминални сигнални секвенции от секретирани белтъ-ци, както и нарязване на полипротеини на по-малки фрагменти. Рязането на белтъците често е свързвано с активиране на белтъци от техни неактивни предшественици.

[ROCK]

10Репликация на ДНК

Обща характеристика

Това е процес, при който в клетката се копира ДНК. Репликацията е необходима за предаване на генетичната информация в клетката да бъде предавана на дъщерните клетки.по време на клетъчното делене. Репликацията се означава като полуконсервати-вен процес. Това означава, че новополучената ДНК има една стара верига, получената от майчината ДНК и една дъщерна, новосинтезирана верига.

Механизмите на реп-ликация са много сходни при много различни орга-низми. Разликите засягат основно ензимите на репли-кация и участващите белтъ-ци. В прокариотните орга-низми като E. coli за репли-кацията отговарят два ензи-ма – ДНК полимераза I и ДНК полимераза III. При еукариотите ДНК се реплицира от 5 ензима (ДНК полимераза α, β, γ, δ и ε). Репликаци-ята трябва да е много точен процес, защото дори много ниско ниво на грешки може да доведе до сериозни промени само след няколко репликации. Точността на репликация-та се гарантира от способността на ензима да проверява дали при удвояването е включен правилният нуклеотид. Това става с обратна 3’-5’ екзонуклеазна активност на ензима, която му позволява да отдели неправилно присъединен нуклеотид и след това да го замести с правилен, използвайки 5’-3’ полимеразна активност Това се означава като коригиране или репарационно свойство на ДНК полимеразата. Критичния мини-мум на грешки при репликацията е една грешка на 5 милиарда нуклеотида.

Репликативна вилка

По време на репликацията двойната верига на клетъчната ДНК прогресивно се разплита, осигурявайки област, в която двете вериги са отделени (едноверижни) и мо-гат да се копират от ДНК полимеразата. Разплитането на двойната верига започва от определено място, наречено начало на репликацията (origin) и прогресивно продължава по дължината на веригата, обикно-вено в двете посоки. Много често началото на репликацията е богато на по-слабо свързани (с две Н-връзки) АТ двойки. Мястото, къде-то се разплита ДНК и се синтези-рат новите вериги се нарича реп-ликативна вилка.

В репликативната вилка стават ня-колко различни процеса:

• Разделяне на двойната верига. Това става с действието на хе-ликазни ензими Постепенното разплитане на веригата е пос-ледвано от последователно свързване на особен белтък, на-речен едноверижно-свързващ белтък (single-strand binding protein, SSB), който предотвратява обратното свързване на двете вериги в двойна спирала.

• Синтеза на водещата и закъсняващата вериги. Синтезата на ДНК от ДНК поли-меразата става само в посока 5’-3’. Тъй като двете вериги на ДНК са антипаралелни (едната има посока 5’-3’, а другата – 3’-5’) за тяхната репликация се използват малко 28 различаващи се механизми. Едната верига, наречена водеща (leading) се реплицира в същата посока, в която се развива веригата, така че синтезата може да става непре-къснато. Другата верига, известна като закъсняваща (lagging) се синте-зира в противоположна посока и трябва да се синтезира прекъснато. Тя се синтезира като серия от сегменти, наречени фрагменти на Оказаки.

• Начало на репликацията (priming). ДНК полимеразата изисква къс, двойновери-жен участък, за да инициира синтезата на ДНК. Този участък се нарича праймер (primer) и се образува от ДНК полимераза, наречена праймаза, която има способ-ността да започне синтезата върху единична верига ДНК. Праймазата синтезира къс РНК праймер върху матрицата, при което се получава къс едноверижен участък. При E. coli след това ДНК полимераза III синтезира ДНК, започвайки от праймера. При закъсняващата верига синтезата спира, когато се стигне до следващия праймер. В то-зи момент започва да действа ДНК полимераза I, която премахва РНК праймера и го замества с ДНК (Фиг. 1.34). При еукариотите ситуацията е различна. Там ДНК по-лимераза α, която има цялостна праймазна активност е отговорна за инициация на репликацията. ДНК се реплицира от ДНК полимерза α и δ, като δ синтезира водеща-та верига, а α - закъсняващата. Другите полимерази имат допълваща роля. ДНК по-лимераза ε участва в репарацията на ДНК, а РНК полимераза γ реплицира ДНК при митохондриите.

• Запълване на едноверижни прекъсвания (лигиране). За да завърши синтезата на закъсняващата верига е необходим един последен етап, при който фрагментите на Оказаки се свързват заедно с фосфодиестерна връзка. Това става с помощта на ензим ДНК лигаза.

1.9.3. Репликация на ДНК при бактериите

Макар, че репликациятa е сходна при всички организми, цялостният процес се различава, в зависимост от характеристиката на ДНК, която се копира. За репликация на пръстеновидните ДНК на бактериите и на линейните ДНК на еукариотите се прила-гат различни стратегии. Най-простият и най често срещан механизъм за репликация на пръстеновидните ДНК е използването на едно начало на репликация, от което започват две репликативни вилки, движещи се в противоположни направления. При това се по-лучават междинни репликативни форми, напомнящи гръцката буква θ (тита), което да-ва и името на модела. В края на краищата двете вилки се срещат, сливат се, и с това репликацията завършва.

Репликацията на ДНК изисква развиване на двойната спирала на ДНК. Това предизвиква въртене на веригата пред репликационната вилка. При пръстеновидните ДНК, които нямат сво-бодни краища това пре-дизвиква суперспирали-зиране на веригата, което спира движението на репликативната вилка. Този проблем се преодолявяа чрез действието на ензими, наречени топоизомерази, които са два типа. ДНК топоизомераза I образува временно прекъсване на едната ве-рига близо пред репликативната вилка, което позволява на веригата да се върти сво-бодно около другата, интактна верига, и това освобождава напрежението от суперспи-рализацията. След това ензимът отново свързва прекъснатите вериги. Когато реплика-цията на бактериалната хромозома завърши, се получават две пръстеновидни дъщерни молекули, чиито пръстени са закачени един за друг. Те се разделят чрез действието на ДНК топоизомераза II, която действа с образуване на временни прекъсвания и на две-те вериги на ДНК, което позволява разделянето на двете дъщерни вериги. След това топоизомераза II свързва прекъснатите вериги.

Репликация на ДНК при еукариотите

Преди клетката да се раздели в нея трябва да се реплицира ДНК. Клетъчното де-лене при еукариотите е във висока степен регулирано и става на серия от различни фа-зи, означавани като клетъчен цикъл. Продължителността на цикъла варира, но обикновено е няколко часа. Най-дългата фаза е G1, при която клетката се приготвя за делене. Тя е последван от S фазата, в която става репликация на ДНК. Следва по-къс G2 период, последван от фаза М. През този период клетката преминава митоза, през която разделяне на хромозомите и делене на клетка-та. След митозата делящите се клетки навлизат в G1 фазата на следващия клетъчния цикъл. В други случаи клетката може да излезе от кле-тъчния цикъл, навлизайки в периода G0, в кой-то не се делят за определено време. Някои клетки, каквито са нервните спират деленето напълно и са непрекъснато в G0 фаза.

Поради голямата дължина на еукариотни-те хромозоми репликацията трябва да започне в множество начала, за да гарантира по-бързата репликация за определеното време. Репликаци-онните вилки се движат в противоположни посоки от всяко начало на репликация, формирайки репликативни мехури, които в края на краищата се срещат и сливат. Репликацията на ДНК от единично начало се нарича репликон. Една типична клетка на бозайник има около 50-100 000 репликона, всеки от които реплицира 40-200 кб ДНК, но не се реплицира цялата ДНК наведнъж. Проце-сът се инициира от група от около 50 репликона едновременно като определени точки в S фазата. Областите, които съдържат транскрипционно-активни гени се реплицират първи, а неактивните участъци – по-късно.

ДНК в еукариотните хромозоми се пакетира в ДНК-белтъчни комплекси, извест-ни като нуклеозоми. С придвижването на репликативната вилка ДНК трябва да се раз-вие, за да се извърши репликацията. Това показва придвижването на репликативната вилка и може да обясни малката дължина на фрагментите на Оказаки на закъсняващата верига при еукариотите (100-200 бази), в сравнение с прокариотите (1000-2000). След преминаването на репликативната вилка нуклеозомите се формират отново. Реплика-цията при линейните еукариотни ДНК има един проблем, който не съществува при пръстеновидните - крайният 5’ край на закъсняващата верига не може да се реплицира, защото няма място за формиране на РНК праймер, който да инициира репликацията. Това създава възможност за скъсяване на хромозомите след всеки цикъл на реплика-ция, което ще доведе до загуба на генетична информация. Проблемът се преодолява чрез наличието на специализиранa структура, наречени теломер, която съдържа тан-демни (един след друг) повторения на прости, некодиращи секвенции. При човека това са 5’ TTAGGG 3’. При добавянето 3’-краят на водещата верига се удължава след 5’-края на закъсняващата верига. Тук действа един ензим, теломераза, който съдържа фраг-мент РНК Този фрагмент частично се застъпва и се свързва с повторената секвенция на водещата верига. След това ензимът удължава водещата верига, използ-вайки РНК като праймер. След това теломеразата се отделя и се свързва за нов теломер, за да удължи во-дещата верига отново. То-зи процес на удължаване може да продължи стоти-ци пъти, преди окончател-ното отделяне на теломе-разта. След това удълже-ните водещи вериги дейс-тват като матрици за реп-ликация на 5’-края на за-късняващата верига . Двата процеса, при които ДНК се скъсява по време на репликацията и удължаването под дейст-вието на тeломеразата катo цяло се балансират, така че общата дължина на хромозомата се запазва.

[ROCK]

11 Регулация на генната експресия при прокариотите

Регулация на генната експресия – обща характеристик

За да функционират бактериите не е необходимо всички гени да бъдат транскри-бирани едновременно. За да се запази енергията и ресурсите бактерията регулира ак-тивността на гените си, така че се експресират само тези гени, чиито продукти са необ-ходими в дадения момент. Например ще бъде излишен разход за бактерията да произ-вежда ензими, които са необходими за синтез на аминокиселина, която в момента е на-лична в клетката. Регулацията на генната експресия позволява бактерията да отговаря на промените на външната среда, най-често по отношение на наличие или липса на хранителни вещества.

Бактерията регулира експресията на своите гени, за да контролира количеството на наличните генни продукти. Нивото на концентрация на генния продукт се поддържа с баланс между неговата синтеза и разграждането на синтезирания белтък. На практика обаче по-голямо значение за този баланс има синтезата на продукта. Скоростта на син-теза потенциално би могла да се повлияе от няколко фактора:

• промяна в скоростта на транскрипция на гените

• промени в скоростта на обмяна на иРНК

• промени в скоростта на транслация

На практика и трите механизма влияят на генната експресия, но най-ясно е влия-нието на регулацията на генната транскрипция.

Организация на бактериалните гени

Една важна характеристика, отразяваща се на начина, по който се регулират гени-те, е тяхната организация в оперони. Това са транскрипционни единици от няколко ге-на, кодиращи белтъци със сродна функция, които се регулират заедно. Има и други ге-ни, кодиращи регулаторни белтъци, които контролират генната експресия на оперони-те. В E. coli са установени много различни оперони. Най-много са опероните, кодиращи ензими за синтеза на аминокиселини или за разграждане на различни субстрати. Опе-роните се класифицират на индуцибилни и репресибилни. Индуцибилните оперони съдържат гени, които кодират ензими, участващи в метаболитните пътища. Експресия-та на гените се контролира от субстрата на този метаболитен път. Пример за индуциби-лен оперон е лактозния (lac), кодиращ ензими, извършващи разграждането на лактоза-та. Репресибилните оперони съдържат гени, които кодират ензими на биосинтетични пътища и експресията се регулира от крайния продукт на тези пътища, които могат да репресират експресията на оперона или да я контролира чрез алтернативен механизъм, наречен атенюация. Пример за репресибилен оперон е триптофановия (trp), който кодира ензими за синтез на триптофан.

Лактозен (lac) operon

Оперонът съдържа три гена, кодиращи ензими за утилазацията на дизахарида лак-тоза в клетката на E. coli. Това са β-галактозид-пермеаза, който транспортира лактоза-та в клетката, β-галактозидаза, който хидролизира лактозата на два монозахарида (глюкоза и галактоза) и β-галактозид трансацетилаза, който ацилира лактозата и съ-що участва в хидролизата на лактозата. Тези ензими се съдържат в клетката в много малка концентрация, но в присъствие на лактоза нивото им бързо нараства. Трите гена са известни като lac A, Z и Y. Те са подредени последователно и се транскрибират в една единствена иРНК от един промотор. Преди оперона (upstream) се намира един ре-гулаторен ген, lac I, който се експресира самостоятелно и кодира синтезата на белтък, наречен lac репресор, който регулира експресията на гените lac Z, Y и A. При липса на лактоза репресорът се свързва с секвенция ДНК, наречена оператор, който се намира между промотора и първия ген lac Z. Когато е свързан с оператора, репресорът блокира пътя на РНК полимеразата при нейното свързване с промотора и предотвратява транск-рипцията. Когато клетката се срещне с лактоза в средата, малкото молекули от ензим в нея позволяват лактозата да бъде приета в клетката и метаболизирана. Алолактозата, изомер на лактозата, който се получава като междинен продукт на метаболизма на лак-тозата служи като индуктор. Той се свързва с лактозния репресор и променя конфор-мацията му така, че той повече не може да се свързва с оператора. Пътят на РНК поли-меразата не е вече блокиран и оперонът се транскрибира. Синтезират се по-големи ко-личества от ензимите, които позволяват да се приеме по-голямо количество лактоза и да се метаболизира. След това присъствието на лактоза индуцира синтезата на повече ензими, които да я метаболизират. Когато лактозата свърши, лактозния репресор възв-ръща конформацията си и отново се свързва с оператора, блокирайки РНК полимераза-та и по този начин изключва оперона.

Катаболитна репресия

Този термин означава един допълнителен регулаторен механизъм, който позволя-ва на lac оперона да отчита наличието на глюкоза, която е алтернативен и предпочитан въглероден енергиен източник от бактерията. Ако в клетката има глюкоза и лактоза, клетката ще използва първо глюкозата с предимство, вместо да използва енергия да разцепва лактозата и тогава да използва глюкозата от този процес. Присъствието на глюкоза изключва lac оперона чрез един механизъм, известен като катаболитна реп-ресия, който използва регулаторен белтък, наречен САР (catabolite activator protein)

САР се свързва с оперона в област преди (upstream) лактозния промотор и ускорява свързването на РНК полимеразата към промотора. При това обаче САР дейст-ва само когато е свързан с един дериват на ATP, наречен цикличен аденозин моно-фосфат (cAMP), чието ниво се определя от нивото на глюкозата. Друг ензим, наречен аденилат циклаза синтезира cAMP oт ATP, а самият той се потиска от глюкозата. Ко-гато в клетката има глюкоза, аденилат циклазата се инхибира и нивото на cAMP е нис-ко. При тези условия САР не се свързва с промотора и lac оперона се експресира слабо. Обратно, когато глюкозата е малко, нивото на cAMP е високо, САР се свързва и нивото на експресия на lac оперона е високо. Ако присъстват едновременно лактоза и глюкоза, lac оперона ще се експресира при много ниско ниво. Когато обаче глюкозата се разгра-ди, катаболитната репресия се премахва и lac оперонът се експресира в зависимост от нивото на лактозата.

Триптофанов (trp) оперон

Оперонът съдържа пет гена, кодиращи ензими, участващи в биосинтезата на ами-нокиселината триптофан. Гените се транскрибират в единична иРНК, транскрибирана от един промотор. Експресията се регулира от нивото на триптофана в клетката. Един регулаторен ген, намиращ се преди промотора синтезира trp репресор. Той се свързва с trp оператор, който се намира непосредствено след trp промотор, като дори

частично се припокрива с него. Когато в клетката има триптофан, той се свързва с реп-ресора и го активира за свързване с оператора, пречейки на свързването на РНК поли-меразата с промотора и по този начин спирайки транскрипцията на оперона. При липса на триптофан репресорът не може да се свърже с оператора и оперонът е свободен да се транскрибира. По този начин триптофанът, като краен продукт от синтезата служи като ко-репресор заедно с trp репресор и инхибира собствената си синтеза.

Атенюация

При експресията на триптофановия оперон се осъществява една алтернативна стратегия за контролиране на транскрипцията, означавана като атенюация, която може да регулира по-фино експресията на оперона. Секвенцията, транскрибирана от участъка между trp промотор и trp гени може да образува две двойноверижни струк-тури от типа стъбло-бримка. Близкото им разположението показва, че двете бримки не могат да се формират едновременно. Във всеки даден момент може да се образува само едната или другата структура. По-голямата и по-стабилна структура не влияе на транс-крипцията. Тя се образува по-близо до промотора, а другата, по-малка се намира след голямата и може да влияе на транскрипцията като транскрипционен терминатор. Ако се формира тази структура тя ще терминира транскрипцията преди още РНК полимераза-та да достигне до първия ген. Атенюацията зависи от факта, че при бактериите транс-лацията на иРНК и свързването на рибозомата започва веднага след като е синтезирано 5’ началото на веригата. Веригата иРНК която се транскрибира може да има една или две рибозоми, прикрепени към нейния 5’-край. Свързването на рибозомите с иРНК мо-же да повлияе формирането на едната или другата бримки и така да определи дали ще настъпи терминация. Непосредствено преди бримковидните структури се намира една отворена рамка на четене от 14 кодона, следвана от стоп кодон, която се транслира преди структурните гени. Два от тези 14 кодона са за триптофан. Ако нивото на трип-тофана в клетката е адекватно, рибозомата ще транслира кодиращата секвенция, дви-жейки се непосредствено след РНК полимеразата. При тези условия присъствието на рибозомата не позволява формирането на първата бримка, при което се формира втора-та, терминираща секвенция, която спира транскрипцията, причинявайки отделяне на РНК полимеразата. Ако липсва триптофан рибозомата ще спре още в началото, което ще позволи на РНК полимеразата да продължи напред и да се образува първата, по-голяма бримка. В този случай се блокира образуването на терминиращата бримка и транскрипцията продължава. Скоростта, с която рибозомата транслира кодиращата об-ласт не е еднаква за всеки транскрипт. Когато нивото на триптофана в средата е в средни граници, при някои транскрипти ще се наблюдава терминация, а при други – не, което позволява фино регулиране на нивото на експресия на оперона. Като цяло trp репресор определя дали оперона ще се включи или изключи, а атенюацията ще опреде-ли колко ефективно ще се транскрибира оперона, като и двата механизма зависят от нивото на триптофана в клетката. Атенюацията позволява на клетката да синтезира триптофан според конкретните изисквания на клетката. Атенюацията не е ограничена само за trp оперон, а се наблюдава при поне още шест оперона, отговорни за синтезата на аминокиселини. Някои от тях се регулират както trp оперон с участие и на оператор и репресор (phe), докато други (his, leu и thr) притежават атенюацията като единствен начин на регулация.

Регулация чрез алтернативни сигма фактори

Бактериалната РНК полимераза е изградена от отделни субединици (2α, β, β’, σ). Една от субединиците, σ (сигма) фактор, е отговорна за инициация на транскрипцията, чрез разпознаване на ДНК секвенцията на бактериалния промотор. Бактериите, вклю-чително и Е. coli, произвеждат алтернативни сигма-фактори, които разпознават различ-ни групи промотори и карат РНК полимеразата да транскрибира различни групи гени. Това се използва като начин за регулация на генната експресия, когато външните усло-вия налагат съществени промени в метаболизма и оттам на генната експресия. Алтер-нативните сигма-фактори се включват в различни ситуации:

• Топлинен шок. Когато бактериите са подложени на действието на високи темпера-тури E. coli транскрибира група от 17 гена, които помагат на клетката да се адаптира към променените условия. В тези случаи се използва σ32 фактор, който разпознава промоторите на гените на топлинния шок.

• Спорулация при Bacillus subtilis. Тази бактерия претърпява спорулация в отговор на различни условия на околната среда. Спорулацията изисква драстични промени генната експресия, което включва блокиране на транскрипцията на много гени за белтъчна синтеза и включване на гени, произвеждащи белтъци, необходими за въ-зобновяване на белтъчната синтеза, когато спората започва да прораства. B. subtilis извършва това с използване на алтернативни σ фактори.

• Бактериофагни σ фактори. Някои бактериофаги използват РНК полимеразата на гостоприемника, като я снабдяват с алтернативен σ фактор, за да я пренасочат да транскрибира фаговите гени с предимство. Други фаги продуцират серия от σ фактори, които позволяват контрол във времето на собствените гени на бактериофага, като ранни гени, транскрибирани от бактериалната РНК полимераза, след което алтернативни σ фактори насочват транскрипцията към средни и късни ге-ни.

[ROCK]

12 Регулация на генната експресия при еукариотите

Генна експресия

Предполага се, че човешкия геном съдържа около 30 000 гена. Те са обект на сложна схема на регулация, която все още не е изцяло изяснена. В еукариотните клетки не всички гени са активни. Клетките експресират едва около 15% от своите клетки; ос-таналите гени остават неактивни. В многоклетъчните организми активните гени могат да са много различни. Гените, които са активни в един клетъчен тип, може да са неак-тивни в друг. Активните гени определят какви белтъци ще се синтезират в клетката и са отговорни за характеристиките на клетката и ролята и в организма. Например в лимфо-цитите, които образуват антитела за борба със заболяванията, гените, които кодират белтъци за производство на антитела се експресират на високо ниво. Схемата, по която се експресират гените може да се мени по време на развитието на клетките. Например кръвните клетки се развиват чрез диференциация на примитивни клетки-предшественици. Промените, които настъпват в клетките по време на диференциация са резултат от промените в схемата на регулация на експресия на гените. Установява-нето на механизмите, по които се регулира генната експресия е важно и за разбирането на механизмите на някои болести като рак, при които ненормалната експресия на гени-те води до неконтролирано клетъчно делене и образуване на тумори.

Регулация на генната експресия

Еукариотните клетки регулират експресията на своите гени основно чрез опреде-ляне на скоростта, с която те се транскрибират в иРНК. Тази разлика може да е много голяма между гени за белтъци, синтезирани в големи количества, които се транскриби-рат с голяма скорост и гени за редки белтъци, които се транскрибират на много ниско ниво. Регулацията на генната експресия се постига чрез взаимодействие между генните промотори и ДНК свързващи белтъци, известни като транскрипционни фактори. Транскрипцията на гените от РНК полимеразата се инициира при промоторите и ефективността на инициацията на транскрипцията може да се променя от взаимодейст-вието на къси регулаторни секвенции в ДНК в промотора и белтъчни транскрипционни фактори. Регулиращите секвенции се намират паралелно на кодиращите секвенции и се означават като цис-действащи.

При еукариотите гените, кодиращи синтеза на белтъци се транскрибират от РНК полимераза II. Транскрипцията се инициира от формирането на транскрипционен ини-циаторен комплекс (TIC), който включва свързване на РНК полимеразата и няколко белтъка, наречени базални транскрипционии фактори към ДНК на промотора към характерна секвенция, известна като TATA блок (вж. раздел 1.4). Той има секвенция 5’ТАТА(А/Т)А(А/Т) 3’ и се намира в повечето, но не във всички еукариотни гени и е локализиран на около 25 bp наляво от старта на транскрипцията (upstream). Ролята му е да разположи РНК полимеразата в правилно положение за инициация на транскрипци-ята. Някои гени, и по-специално тези, експресирани само в специфични клетки нямат ТАТА блок, а обикновено имат инициаторна секвенция, разположена върху транскрип-ционната стартова секвенция. Други гени, обикновено тези, експресирани много слабо нямат нито ТАТА, нито инициаторен елемент.

Ефективността на инициация на транскрипцията, а оттам на количеството синтезирана иРНК се определя от допълнителни транскрипционни фактори, които се свързват с други секвенции ДНК в промотора и могат да взаимодействат с белтъците в ТIС, влия-ейки на неговата стабилност. Транскрипционните фактори могат да ускорят или да на-малят скоростта на транскрипцията. Има много различни транскрипционни фактори, всеки от който разпознава и се свързва с определена секвенция ДНК в промотора. Раз-познаваните секвенции могат да се различават в различните промотори и мястото за свързване се означава обикновено като консенсусна секвенция. Транскрипционните фактори се синтезират в цитоплазмата, но осъществяват действието си в ядрото. По този начин те често се означават като транс-действащи фактори.

Нивото на експресия на гените може да се повлияе и от действието на секвенци-онни елементи, наречени енхансери, които могат да бъдат локализирани на хиляди нуклеотидни двойки от промотора. Обикновено енхансерите са с дължина 100-200 нд и съдържат секвенции, които свързват транскрипционни фактори, които могат да ускорят транскрипцията на свързания с тях ген. Разположението на енхансерите спрямо гените, които регулират е различно и може да е отляво или отдясно на стартовата точка на транскрипцията. Енхансерите работят независимо от тяхната ориентация и са еднакво ефективни и в двете посоки. Най-вероятно взаимодействието между енхансера и него-вия промотор става чрез нагъване на веригата ДНК между тях, което ги довежда в близко съседство. Някои енхансерни елементи се свързват с транскрипционни фактори, които влияят негативно на транскрипцията. Те са известни като заглушители (silencers) и е възможно те да са отговорни за потискане на гени в определени клетъчни типове. Други елементи, които действат от разстояние са локусните контролни еле-менти (locus control elements), които могат да регулират цели семейства гени чрез кон-тролиране на транскрипционните белтъци до ДНК. Пример за това са подобни елемен-ти, контролиращи глобиновото семейство гени.

Транскрипционни фактори

Съществува голямо семейство белтъци, които регулират експресията на гените, кодиращи белтъци. Те са различни от факторите на базалната транскрипция, които вза-имодействат с РНК полимераза II, за да формират TIC. Транскрипционните фактори показват много различни начини на експресия: някои се синтезират само в определени клетъчни типове, докато други присъстват във всички клетки. Всеки транскрипционен фактор, свързан с промотора на дадения ген може да му влияе позитивно или негатив-но. Общия ефект върху транскрипцията зависи от баланса на свързаните транскрипци-онни фактори. Способността на факторите да образуват димери със себе си и с други фактори дава още по-голямо разнообразие на начините на регулация на генната експре-сия.

Транскрипционните фактори имат модулна структура и са съставени от отделни белтъчни домени със специфични функции. Като цяло се срещат три типа домени:

• ДНК свързващи домени;

• димеризационни домени;

• трансактивационни домени.

ДНК свързващите домени и димеризационните домени съдържат характерни бел-тъчни структури, наречени мотиви (motifs).

ДНК свързващи домени

Има три типа ДНК свързващи домени, които се характеризират на базата на тех-ните мотиви.

• Спирала-извивка-спирала. Този мотив е образуван от две α спирали, разделе-ни от β бримка. Една от спиралите, наречена разпознаваща спирала се свързва с ДНК, като контактува с голямата бразда на двойната спирала. Пример за белтък, който съ-

държа този мотив е хомеодоменното семейство транскрипционни фактори, кодирани от група хомеотични гени, а домена в тях се кодира от една високо-консервативна сек-венция, наречена хомеобокс (homeobox). Тези гени играят важна роля в ембриологич-ното развитие.

• Цинкови пръсти (Zink fingers). Този мотив за свързва-не с ДНК се проявява в две форми, наречени С2Н2 и С4. Формата С2Н2 има бримка от 12 аминокиселини, закотвени за основата от два цистеина и два хистидина, които са свързани с координационни връзки с един атом цинк. Мотивът оформя компактна структура, образува-на от две β вериги и една α спи-рала, които съдържат базови аминокиселини, които взаимо-действат с ДНК в голямата бразда на двойната спирала. Този мотив се повтаря множес-тво пъти в домена за свързване с ДНК и обикновено за свърз-ването са необходими два или три мотива. Пример за подобен мотив се намира при широко експресирания транскрипционен фактор Sp1. Мотивът С4 има подобна структура, но има четири цистеина, които са свързани с цинк. Пример за такъв тип домен се открива при транскрипционните фактори за стероидните хормони.

• Базови домени. Тези ДНК свързващи домени обикновено се откриват заедно с един от два димеризиращи домена, наречени лейцинов зип или спирала-бримка спира-ла (HLH), който дава основен лейцинов зип (bZIP) и основни HLH белтъци. Свързване-то на ДНК изисква два основни домена, които се свързват заедно чрез димеризация.

• Димеризационни домени

В димеризационните домени са намерени два типа мотиви:

• Мотив, наречен лейцинов зип, който обикновено се намира на карбоксилния край на ДНК свързващия домен. Той съдържа α спирала, като всяка седма аминокисе-лина е лейцин, като освен това лейцинът се намира на една и съща страна на спиралата на всеки втори оборот на спиралата, като по този начин формира една хидрофобна по-върхност. Димеризацията се постига чрез контактуване на хидрофобните страни на два лейцинови зипа, при което от двата близко разположени белтъка се образуват ДНК свързващи домени. Двата ДНК свързващи домена имат противопололожна посока, кое-то им позволява да свържат двете антипаралелни вериги на ДНК.

• HLH димеризационен домен, който съдържа две α спирали, разделени от нес-пирална бримка. Димеризацията се постига чрез взаимодействие между хидрофобни аминокиселини, намиращи се на едната страна на терминалния С-край. Димеризация може да стане не само между две молекули на един и същ транскрипционен фактор (хомодимер), но и между различни транскрипционни фактори със същия димеризацио-нен домен (хетеродимер). Формирането на хетеродимери дава транскрипционни фактори с нови функции и повишава способността им за регулиране експресията на гените, които те контролират. Пример за това е семейството транскрипционни фактори MyoD, които формират хомо- и хетеродимери, които генната експресия на развиващи се мус-кулни клетки.

Активационни домени

За разлика от ДНК свързващите и димеризационните домени, не са намерени мо-тиви, които да характеризират активационните домени. Анализът на аминокиселинната секвенция показва само, че тези домени са обогатени на определени аминокиселини. Така например са установени активационни домени, богати на кисели АК (например активационния фактор Ga14 в дрожди), глутамин (транскрипционен фактор Sp1), про-лин (например транскрипционните фактори c-Jun Ap2 и Oct-2).

Транскрипционните фактори регулират подлежащите им гени чрез свързване с TIC и промяна на тяхната стабилност. Възможно е активационните домени да взаимо-действат с различни белтъци в TIC и на поредица етапи от инициация и елонгация на транскрипцията.

Някои транскрипционни фактори могат да потискат транскрипцията. Това може да се постигне по различен начин. Някои могат да я потискат, като директно контакту-ват с транскрипционния инициаторен комплекс. Други могат да действат непряко, по различни начини, включително: (а) блокиране на ДНК свързващия участък на актива-ционния фактор; (b) формиране на димер, в който няма ДНК свързващ домен или (с) свързване на репресорен белтък към активационния домен на друг транскрипционен фактор.

Регулиране на генната експресия от хормони и цитокини

Хормоните са агенти, произвеждани от клетката, които влияят на други клетки, влияещи на техните характеристики и функции чрез активиране транскрипцията на специфични гени. Хормоните може да са малки молекули, често стероиди, каквито са естрогените и глюкокортикоидите, или полипептиди, какъвто е инсулина. Цитокините са белтъци, които влияят по подобен на хормоните начин, като често тяхната цел са кръвните клетки. Хормоните и цитокините модулират генната експресия на таргетните клетки по различни начини. Стероидните хормони са мастноразтворими и могат да преминават през клетъчната мембрана и да навлизат в цитоплазмата, където се свързват с транскрипционни фактори, наречени рецептор на стероидните хормони. Свързване-то предизвиква освобождаване на рецептора на стероидните хормони от инхибиторни протеини. След това той димеризира и се прехвърля в ядрото, където активира транск-рипцията на таргетните гени чрез свързване с промоторните секвенции. Полипептидни-те хормони и цитокините действат по различен начин, като се свързват с рецепторни белтъци на повърхността на клетката, която ще регулират. Активирането на гените в този случай става с един процес, който се нарича сигнална трансдукция, при която последователно чрез фосфорилиране се активира верига от белтъци. В края това води до стимулиране на транскрипцията на гените, чрез свързване на транскрипционните фактори с промоторите им.

[ROCK]

РАЗДЕЛ 2 ГЕНОМИ

13 ГЕНОМИ

2.1. Хромозоми

2.1.1. Прокариотни и еукариотни хромозоми

Всички живи клетъчни форми имат структури, които носят гените, кодирани от ДНК, наречени хромозоми. Въпреки общия термин, съществуват значителни различия между прокариотните хромозоми и дори тези на най-простите еукариоти. При прокари-отите хромозомите се състоят от една двойноверижна ДНК, която е обикновено пръс-теновидна и има сравнително малко белтъци, свързани с нея. Репликацията на тази ве-рига става от едно начало на репликация (origin), както бе описано по-рано (вж. раздел 1.9). В повечето случаи еукариотните организми имат множество хромозоми, които са линейни и са локализирани в мембранния органел – ядрото. В тези хромозоми молеку-лата ДНК е тясно асоциирана с голямо количество специфични белтъци, които могат да имат структурна или функционална роля. Количеството на ДНК в еукариотните хромо-зоми е многократно по-голямо от това в прокариотните. По-тази причина репликацията в тях започва в множество начални места.

2.1.2. Морфология на хромозомите

Еукариотните хромозоми са обикновено видими само в определени периоди на делене на клетката (вж. раздели 2.2 и 3.3), след като хромозомите са се реплицирали в специални двойни структури, наречени хроматиди (дъщерни хромозоми). Хромозомите се класифицират на базата на тяхната морфология, а тя се определя от мястото на цен-тромера (първичното прещъпване). На Фиг. 2.1 са показани няколко типични структу-ри на хромозоми. При метацентричните (медиоцентрични) хромозоми центромерът е близо до средата на хромозомата. Това разде-ля хромозомата на две сравнително равни части – рамене. Когато центромерът е на зна-чително по-голямо разстояние от средата, при което се формират две рамена – дълго (q-рамо) и късо (p-рамо), хромозомите се озна-чават като субметацентрични. При другите два класа центромерът е много близо до еди-ния край на хромозомата. При телоцентрич-ните хромозоми центромерът е в единия край на хромозомата, при което се наблюдава само едно рамо. Ако центромерът е толкова близо до края, че рамената са едва забележими, хромозомите се наричат акроцентрични. Двата последни типа могат лесно да се обър-кат. Разликата между тях се забелязва лесно върху човешките хромозоми (Фиг. 2.2).

Пълният диплоиден набор хромозоми при всеки вид се нарича кариотип. Хромо-зомите се подреждат по намаляваща големина и се разделят на полови хромозоми (X и Y) и аутозоми (всички останали; вж. раздел 3.8). Хромозомите могат да се фотографи-рат и хомоложните хромозоми да се подредят по двойки и по ред. Това се означава като идеограма и е обикновеният начин за показване на кариотипа.

Чрез подреждането на хромозомите по големина и морфология е възможно да се идентифицира всяка индивидуална хромозома в кариотипа. Този процес е направен значително по-лесен с прилагане на специални процеси на третиране преди багрене. Това дава поредица тъмни и светли зони, уникални за всяка хромозома. Този начин на изследване се нарича бендинг (banding, от band – ивица, зона). Макар, че съществуват множество способи, най-широко използвани са т. нар G-бендинг и С- бендинг.

G-бендинг може да се постигне с множество третирания, но най-широко се из-ползва предварително третиране на препаратите с хромозоми с протеолитични ензими, като например трипсин. Така обработените препарати се багрят по Giemsa (оттам про-излиза и името G-бендинг). Това третиране дава тъмни ивици и по-светли интервали. Наборът светли и тъмни зони е уникален за всяка хомоложна хромозомна двойка и по-мага изключително много за идентифициране на хромозомите. Тези набори са използ-вани за съставяне на цитологични карти на всяка хромозома при много видове, при ко-ето могат точно да се дефинират и субхромозомни области. Това е особено важно за картиране на гените и в медицинската генетика (Глава 13).

На фиг. 2.2 може да се види диаграма на G-бендинг зоните на всяка човешка хро-мозома. Този набор позволява всяка отделна хромозома да се раздели на области и по-добласти. Ако се използва хромозома 1 като пример, първото делене се прави между двете рамена (q и р). По-нататък се вижда, че q-рамото се дели на области 1, 2, 3 и 4. Има още две допълнителни нива на разделяне, така че една специфична област може да се дефинира с означението 1.q.42.1. Трябва да се отбележи, че не всички хромозоми и дори хромозомни области са разделени еднакво. Тези области са субективни и са дефи-нирани със специални конвенции на цитогенетиците. Като се има предвид, че подобни багрения могат да се прилагат и на по-дълги и на по-малко кондензирани хромозоми, броят на суб-регионите може да се увеличи значително. G-бендингът не само дава удо-бен начин за идентифициране на хромозомите, но и говори за общата организацията на ДНК и гените в еукариотните хромозоми. Като цяло тъмните зони са по-богати на ба-зите аденин и тимин, а по-светлите на гуанин и цитозин. Повечето гени са локализира-ни по-скоро в интервалите, отколкото в G-зоните.

С-бендингът също дава информация за организацията на хромозомите. Той дава определен брой тъмни зони, които са обикновено около центромерите. Те показват об-ластите на конститутивния хетерохроматин, които ще бъдат разгледани подробно по-късно.

2.1.3. Специализирана организация на хромозомите

Всички еукариотни хромозоми имат две специфични области с особено структур-но значение. Това са центромерите и теломерите. В допълнение някои хромозоми имат област на ядърцевия организатор (nucleolar organizer region - NOR). Центроме-рите са местата, където делителното вретено е свързано с хромозомите по време на де-лене на клетката и функционалните центромери са важни за този процес. Всеки хромо-зомен фрагмент, който загуби връзката си към центромера няма да се сегрегира в дъ-щерните клетки в края на клетъчното делене. Най-добре са проучени центромерите при дрождените хромозоми, някои от които са доста къси (до 200 нд), но повечето центро-мери са доста по-дълги. Обикновено центромерите се състоят от често повтарящи се фрагменти от сателитна ДНК (вж. раздел 2.4). При хората различните хромозоми могат да се отдиференцират по наличието на специална алфовидна сателитна ДНК в центро-мерите. Връзката между хромозомата и микротръбиците на делителното вретено се осъществява чрез специални белтъци, които са свързани с центромера и образуват мно-гослойна структура, наречена кинетохор.

Теломерите не са просто краищата на хромозомите и ДНК молекулите, а са спе-циализирани структури. Те съдържат множествени повторения на секвенции като TTAGGG. Няма обаче голяма специфика в различните организми – подобни секвенции са открити и в растения и в първаци. Към теломерните области се свързват специфични белтъци и се предполага, че получените нуклеопротеидни структури предотвратяват рекомбинацията между краищата на различните хромозоми. Броят на повторенията в теломерите е висок в младите делящи се клетки и постепенно намалява с възрастта на соматичните тъкани, поради което може да се счита, че това е молекулен маркер на процеса стареене. Дължината на теломерите се регулира от ензима теломераза, който съдържа фрагменти РНК, комплементарни на повторенията от ДНК, а те играят роля на матрици за удължаване на теломерите. Теломеразата липсва в соматичните клетки, но се появява отново в туморните клетки, където дължината на теломерите се стабилизи-ра.

NOR се откриват обикновено в т. нар. вторични прещъпвания. Те се състоят от тандемно повторени гени за рибозомните гени за 5,8S, 18S и 28S (вж. 1.6). В повечето организми гените за 5S рРНК са локализирани на други места в генома. В човешкия ге

ном NOR са локализирани на късите рамена на всички алоцентрични хромозоми, с изк-лючение на Y хромозомата. Всеки NOR се състои от около 80-100 повторения. По вре-ме на интерфазата NOR се декондензира и около него отново се организира ядърце, при което NOR от различните хромозоми се обединяват в едно ядърце. Когато клетката навлезе в метафазата на митотичното делене, хромозомите могат да се окажат все още свързани с късите си рамена, което е известно като сателитна асоциация.

Вторичното прещъпване може да е толкова силно изразено, че една малка дистал-на част от хромозомата изглежда почти отделена от нея и се нарича хромозомен сате-лит. При човека те могат да се видят на хромозоми 13, 14, 15 и 21 (Фиг. 2.2). Хромо-зомният сателит не бива да се бърка със сателитната ДНК (вж. 2.4).

2.1.4. Молекулярна структура на хромозомите

Хромозомите са съставени от ДНК и белтък. Може да има и малко количество РНК, която обаче няма функционална роля в тях. Сместа от ДНК и белтък се нарича хроматин. Белтъците се делят на два класа – хистонови и нехистонови или кисели белтъци, като и двата типа играят важна роля в структурата и функцията на хромозоми-те. Хистоните са група малки белтъци с молекулна маса под 23 kD. Като съотношение те са равни на количеството на ДНК в хромозомите. При физиоло-гично pH те има положителен за-ряд, който се дължи на големия процент базови аминокиселини ка-то аргинин и лизин. Този заряд по-мага за стабилната връзка с полиа-ниона ДНК. Установени са пет различни хистона Н1, Н2а, Н2b, H3 и Н4. Това се отнася до всички ор-ганизми и тъкани, с малки изклю-чения по отношение на Н1. Ами-нокиселинната секвенция на всеки хистон е високо-консервативна от еволюционна гледна точка, което показва, че тези молекули имат го-лямо значение, критично за прежи-вяването на еукариотите. Този факт е обяснен с откриване на нуклеозомите – основната градив-на единица на хроматина.

Нуклеозомите се състоят от ядро, изградено от хистони, около което се увива веригата на ДНК. Ядрото се състои от два успоредни диска, образувани от по четири хистона - Н2а, Н2b, H3 и Н4. ДНК е разположена по ръбовете на цилиндъ-ра, образуван от дисковете. Хистонът Н1 се намира отвън на цилиндъра и фиксира на-вивките на ДНК. В нуклеозомата участва ДНК с дължина 146 нд. Участъкът от свърз-ващата ДНК между две нуклезоми се нарича линкер и варира в различните видове, но при човека е около 60 нд, което дава обща дължина на ДНК в една нуклеозома около 200 нд. Това е основното ниво на пакетиране на ДНК в хроматина. По-нататъшното па-кетиране в голяма степен зависи от хистона H1. Молекулите Н1 могат да си взаимо-действат и да организират нуклеозомите в спирална структура (solenoid) с диаметър 30 nm. Това е диаметърът на нишката, която най-често се вижда на електронните микрог рафии на хроматина, но са открити и някои по-плътно опаковани структури. Една прос-та структура на соленоид е представена на фиг. 2.3. В ядрото се наблюдават и структу-ри с по-висока степен на кондензация. Най-висока плътност се наблюдава в хромозо-мите по време на метафазата на клетъчното делене. Организирането на тези структури представлява свързване на хроматиновите нишки към скелета на хромозомата. Основна роля в това играе киселият ядрен белтък, топоизомераза II. Има специфични области на ДНК с дължина неколкостотин нуклеотидни двойки, богати на базите аденин и ти-мин, които са известни като области за свързване със скелета (scaffold attachment regions, SARs), и които свързват нишките ДНК със скелета. Веригите ДНК между тях са организирани като бримки с различна дължина. ДНК от тези област може да се види ако се премахнат хистоните в препарати от метафазни хромозоми. Тогава електронните снимки показват бримките, излизащи от скелета на хромозомите. Нехистоновите ядре-ни белтъци участват по различен начин във функционирането на хроматина като нап-ример регулация на генната експресия, където транскрипционните фактори играят съ-ществена роля. По-подробно тези процеси са разгледани в раздел 2.11.

2.1.4. Функционален и нефункционален хроматин

Не всички области на хроматина участват еднакво в транскрипцията на гените. Известна част от хроматина е функционално неактивна. Тази част е известна като хете-рохроматин, за разлика от функционално-активната му част – еухроматин. Както се вижда от електронно-микроскопските снимки хетерохроматинът има по-плътно опако-вана структура на хроматиновите нишки. Той може също така да се отдиференцира и с багрене на светлинна микроскопия. Част от хроматина е хетерохроматин във всички тъкани и всички етапи на развитие на клетката, нарича се конститутивен хроматин и може да се открие чрез С-бендинг. Както беше споменато по-горе със С-бендинг се от-криват центромерите. В тези области има здраво свързване на ДНК и белтък, което на-малява загубата на ДНК при обработката за С-бендинг, поради което тези области се багрят по-интензивно. Други области с конститутивен хроматин има в дългото рамо на човешката Y-хромозома и в области на половите хромозоми на някои животни. Подоб-ни С-зони се срещат по-често при растенията, където те се използват за идентифицира-не на хромозомите, тъй като при растителните хромозоми не се наблюдава G-бендинг.

Някои области на хроматина могат да съществуват или в хетерохроматиново или в еухроматиново състояние. Такива области се наричат факултативен хетерохрома-тин. Женските бозайници имат две Х-хромозоми, като едната е неактивна по отноше-ние на транскрипцията. Тя се превръща в хетерохроматин и се наблюдава като малка плътна точка в интерфазното ядро, известна като телце на Бар или Х-хроматин. По този начин се осъществява компенсация в броя на експресираните гени с мъжките ин-дивиди, които имат само една Х-хромозома и една Y-хромозома, която също се състои основно от хетерохроматин. Коя от двете Х-хромозоми ще се инактивира е случаен процес. При около половината от женските екземпляри се инактивира Х-хромозомата с произход от мъжкия родител, а при другата половина – от женския. Инактивираната Х-хромозома се реактивира по време на гаметогенезата.

2.1.5. Аберации в броя на хромозомите

Промяна в броя на хромозомите може да се получи при грешки по време на мейо-зата, процес, свързан с гаметогенезата (3.3). В резултат на това се получават гамети със загуба или излишък на генетичен материал. Ако гаметите са жизнени те ще дадат по-томство със същата абнормална конфигурация на хромозомите. Грешки, които стават по време на митозата (вж. раздел 2.2) дават поколение с повече от един кариотип. Та-кива индивиди се наричат мозаечни, тъй като хромозомни аберации има само в опре-

делени участъци, които са изградени от поколенията на клетката, в която е станала абе-рацията.

Полиплоидия се получава тогава, когато броят на хромозомите се увеличава или намалява с число, кратно на хаплоидния набор. Еуплоидните серии показват различни плоидни нива. Един пример за човешкия геном е даден в Табл. 2.1. Триплоидите и тет-раплоидите представляват около 10% от спонтанните аборти и никога не се наблюдават при живи деца. Полиплоидията е рядка в животинското царство, но се среща често при растенията, при които е важна за еволюцията. Много от важните културни растения са полиплоиди. Обикновено при тези растенията се наблюдава по-голяма продуктивност, на базата на многото копия гени.

Таблица 2.1. Човешки еуплоидни серии

Брой хромозоми Плоидност Нормално се открива в

23 Хаплоид Тетраплоид

46 Диплоид Соматични клетки

69 Триплоид

96 Гамети

Анеуплоидията се отнася до случаи, при които се наблюдават малки отклонения в хромозомните от еуплоидния набор. Нулизомията е липса на едно копие от опреде-лена хромозома. Като дизомия се означава наличие на две копия на хромозомата, а при тризомията има три копия. Монозомията е нормална при гаметите, дизомията е харак-терна при соматичните, диплоидни клетки. На табл. 2.2 са представени случаи на ане-уплоидия при човешкия хромозомен набор.

Таблица 2.2. Анеуплоидии в човешките популации

Състояние Участващи хромозоми Приблизителна честота

Допълнителна аутозомна 18 1 на 5 000

хромозома 13 1 на 5 000

Синдром на Едуард 21 1 на 750

Синдром на Пато XO 1 на 10 000

Сндром на Даун ХXY 1 на 2 000

Анеуплоидия на полова хромозома XXX 1 на 2 000

Синдром на Търнър

Синдром на Килфелтер

Синдром на тройна Х хромозома

Установена е анеуплоидия и за някои други гени, освен посочените, но само в за-родиши от спонтанен аборт. Като цяло се счита, че около 4% от човешките аборти са резултат на тризомия. При зародиши, които при този дефект оживяват, се предполага сравнително кратко време на живот. Индивиди, при които има тризомия само по част от хромозомата проявяват отрицателните признаци значително по-слабо. Тук трябва да се отбележи, че в този смисъл аутозомните тризомии, отбелязани по-горе, се отнасят до малките хромозоми. Присъствието на допълнително копие от една голяма хромозома вероятно ще доведе до експресия на прекалено много гени, за да се развие зародиш.

Анеуплоидия на полови хромозоми е сравнително често явление, въпреки, че Х-хромозомата спада към големите хромозоми, носещи много гени. Как може да се обяс-ни това? Както беше отбелязано по-рано, само едната Х-хромозома е активна по отно-шение на транскрипцията, така че присъствието на още една хромозома има по-малък ефект, отколкото бихме могли да предположим. Синдромът на Търнър (ХО) е по-рядък от другите полови анеуплоидии и често се среща като мозайка, където е смесен с (ХХ) клетки и това може да улесни преживяването.

Анеуплоидни гамети се получават от грешки при първото или второто делене на мейозата чрез един процес, при който се нарушава разделянето (nondisjunction). Това може да стане например когато две хомоложни хромозоми при мейоза 1 или центроме-рът не успее да се раздели при метафазата на мейоза 2. (вж. раздел 3.3). Подобен процес при центромера може да се получи и при митозата. Счита се, че неразделянето възник-ва като спонтанен процес, подобен на мутациите в секвенцията на ДНК, но все пак се влияе от някои външни фактори. Това се вижда ясно при тризомията на хромозома 21, където случаите се увеличават с възрастта на майката. В някои случаи има семейна предразположеност към тризомия 21, поради наличието на носители в семейството, ко-ито имат нормален фенотип, но имат транслокация на хромозома 21. Те могат да пре-дадат на поколението си или нормалното копие на хромозома 21 или транслокация, ко-ято също съдържа хромозома 21. Засегнатото дете унаследява и нормално копие на хромозома 21 от другия родител и така ще има три копия от хромозомата. Това е опи-сано на Фиг. 2.4.

Носител Нормален Резултат

21, 14 21, 14 Жизнен, нормален

21/14 21, 14 Жизнен, носител

21, 21/14 21, 14 Тризомия 21

14 21, 14 Летален нулизомик

14, 21/14 21, 14 Не жизнен

21 21, 14 Летален нулизомик

Фиг. 2.4. Унаследяване на тризомия 21 (Синдром на Даун). Ако индивидът е носител на три-зомия 21, поради наличие на транслокация между хромозома 21 и хромозома 14, ще се получат ге-нетично различни гамети в резултат на неравномерната сегрегация на транслокацията при мейо-зата. Тези гамети ще се оплодят от нормални гамети, монозомни за хромозоми 21 и 14. Двете гру-пи гамети и резултатът на тяхното сливане са показани по-горе. Транслокацията е означена като 21/14. Трябва да се отбележи, че честотата на получаване на различни гамети не еднаква.

Всички описани синдроми, с изключение на синдромът на Търнър (ХО), показват наличие на една допълнителна хромозома. Индивиди със загуба на една хромозома, или монозомици, са много редки и имат много кратък живот. При човека нулизомиците ни-кога не са жизнеспособни. При растенията нещата са много различни. Там има много мутанти-нулизомици, които са жизнени и освен това се използват при контролни кръс-тоски с цел характеризиране на генома.

2._________2.1__________.doc

Редактирано Юни 25, 2007 от ROCK